Después de la exposición a radiación UV-C, las células bacterianas aisladas a partir de los suelos de las Pampas de la Joya, muestran un incremento en la concentración intracelular de Mn (II) (Fig. 28). En la especie bacteriana M. radiotolerans, el incremento intracelular alcanza un valor de 3.9 mM y la especie R. kroppenstedtii sólo llega a una concentración de 2,2 mM de Mn (II).
Fig. 28. Efecto de la radiación UV-C sobre la concentración intracelular de manganeso (mM) en cepas de R. kroppenstedtii y M. radiotolerans aislasdas a partir de suelos de las Pampas de la Joya. Los resultados corresponden a promedios de tres repeticiones. La barra de color verde representa a los niveles de Mn en las cepas control y las demás barras de color representan los niveles de Mn de bacterias tratadas con diferentes dosis de radiación UV-C.
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CAPÍTULO IV
DISCUSIÓN
Se ha demostrado que la resistencia a la radiación esta relacionada con las características fenotípicas, genotípicas, enzimaticas y fisiológicas de los microorganismos (Krisko y Radman, 2010). Estas características juegan un papel fundamental en la recuperación de las células que han sido expuestas a radiación ultravioleta (Daly, 2009). En el presente trabajo se muestra que dichas características intervienen en la resistencia a la radiación, sobre todo la bioacumulacion de Mn (II).
Las Pampas de la Joya (Arequipa), zona muestreada en el presente trabajo, es conciderada como uno de los desiertos más antiguos de la Tierra (Valdivia-Silva et al., 2012) y forma parte del desierto de Atacama, el cual se extiende desde Chile hasta el sur del Perú. Durante los últimos años, muchos científicos han realizado diferentes estudios
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metereológicos y fisicoquímicos en los suelos de las Pampas de la Joya (Valdivia-Silva
et al., 2012), y se ha encontrado que presentan bajos niveles de materia orgánica y alta actividad oxidante (Valdivia-Silva et al., 2012). Este conjunto de condiciones imposibilita el normal desarrollo de todo tipo de vida (de plantas, animales y del hombre mismo), convirtiéndola en un ambiente extremófilo (Horikoshi et al., 2010). Las evidencias geológicas y mineralógicas sugieren que éstas condiciones extremas, de las Pampas de la Joya, han persistido entre 15 y 25 millones de años, con algunos episodios húmedos en los últimos 4 millones de años (Dunai et al., 2005; Evenstar et al., 2005). A pesar de estas condiciones, nuestro estudio demuestra que la vida en este ecosistema aún es posible, ya que se han encontrado diferentes microorganismos, que por las condiciones en las que viven, pueden ser considerados microorganismos extremófilos.
Se sabe que las condiciones hiperáridas (extrema sequedad) de un determinado lugar, como un desierto, pueden ocasionar daño celular a nivel molecular, tan igual como lo produciría la radiación ultravioleta (Daly et al., 2007; 2010). Este daño ha sido estudiado durante tres décadas, en relación con los daños moleculares y los mecanismos de protección contra la radiación y la desecación, llegando a la conclusión de que ambos tipos de daño son muy similares (Ghosal et al., 2004). En base a estos datos, se decidió muestrear en cuatro tipos de suelos hiperáridos de Las Pampas de la Joya, ya que si los microorganismos que habitan estos ambientes son resistentes a la desecación también podrían ser resistentes a la radiación.
En nuestro estudio se logró aislar 40 cepas diferentes del Desierto de las Pampas de la Joya (Tabla 5). En otros estudios, como los realizados por Kuhlman et al. (2005), se logró aislar solamente cinco cepas diferentes, pertenecientes al orden de los Actinomycetales, luego de exponer las muestras de suelo de las montañas de Whipple a radiación UV-C (156 J.m- 2), Yu et al. (2015) aislaron bacterias resistentes a la radiación del desierto de Taklimakan en China, los cuales reportaron por primera vez los géneros Knoellia, Lysobacter, Nocardioides, Paracoccus, Pontibacter, Rufibacter y Microvirga como géneros resistentes a radiación. Por otro lado, Paulino-Lima et al. (2016), lograron aislar de los suelos de los desierto de Sonora, de Ames Rersearch Center y del Desierto de Atacama un total de 106 cepas diferentes, luego de haberlas expuesto a radiación UV-C (300 J/m2),
dentro de esta amplia diversidad, solo se reportó siete especies del género Bacillus sp. en el desierto de Atacama.
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En nuestro trabajo se utilizó la radiación UV-C para el tratamiento de las bacterias recolectadas de las Pampas de la Joya, por ser eficaz en la inactivación de los microorganismos (Shick y Dunlap, 2002; Slade y Radman, 2011; Urbano et al., 2013; Gabani y Singh, 2013, Paulino-Lima et al., 2013; 2016). Sin embargo, nuestros resultados nos muestran que de las 40 especies bacterianas irradiadas con una dosis de 300 J/m2 de UV-C, 38 especies resultaron ser menos viables y solo 2 especies resultaron ser más resistentes (R. kroppenstedtii. y M. radiotolerans). La baja viabilidad de las primeras 38 especies probablemente se debe a que la radiación UV-C provoca daños directos al ADN y a las proteínas por la energía de los fotones depositados sobre estas moléculas (Culotta y Daly, 2012) pero también podría deberse a daños indirectos sobre el ADN por acción de los radicales hidroxilo (ROS), formados a partir de la descomposición química del agua intracelular propia de las células, por lo que se afirma que los efectos dañinos de la radiación, pueden ser dos a tres veces más letales que los daños ocasionados por la desecación (Daly, 2012).
Por otro lado, se afirma que las diferentes formas de la radiación generan diversos efectos en los sistemas biológicos (Daly, 2009), por lo que exige en ellos, mecanismos variados de protección o reparación (Krisko y Radman, 2010). Una de las observaciones que hicieron Dueholm et al. (2013) y Drees et al. (2006), fué que las células individuales o desagrupadas sufrían mayor daño por la radiación, mientras que los agregados celulares requerían de dosis más altas de radiación. En nuestro trabajo, durante el crecimiento celular, se observó, que las células bacterianas de M. radiotolerans crecían de manera agrupada, todo lo contrario a las células bacterianas de R. kroppenstedtii, cuyas células presentaban un crecimiento desagrupado, teniendo en cuenta que la agregación celular, atenúa la transmisión de radiación UV a las células ubicadas más profundamente en el agregado, esto explicaría porqué nuestras células de R. kroppenstedtii son menos resistentes a la radiación ultravioleta, resultados semejantes han sido observados para las bacterias del género Geodermatophylus y del género Hymenobacter (Paulo-Lima et al.,
2016).
Otros mecanismos utilizados por las bacterias para hacer frente al daño causado por la radiación ultravioleta son: la producción de pigmentos como betacarotenos de color rojo, rosa y amarillo (Jacobs et al., 2005; Veyrier et al., 2011), las cuales por la resonancia ocacionada en los anillos de los betacarotenos por los fotones de luz minimizan el efecto de los radicales libres (Darvin et al., 2007). Una caracterítica bioquímica es la producción
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de la enzima catalasa (Daly, 2012), y otra caracterítica molecular es el tamaño genómico, pues las células con genomas más pequeños sufren menos daño a la radiación que los genomas de gran tamaño (Makarova et al., 2001). El otro mecanismso utilizado por las bacterias para hacer frente a la radiación ultravioleta es la capacidad bioacumuladora de Mn (II); este metal es requerido por la catalasa como cofactor para la degradación del peróxido de hidrógeno (Antonyuk et al., 2000).
Dentro de las características bioquímicas observadas en los microorganismos estudiados, es que todos fueron catalasa positivos. La importancia de la catalasa en las células en relación con la resistencia a la radiación es que esta enzima participa en la eliminación de peróxidos generados por efecto de la radiación ultravioleta, estos peróxidos son productos finales del metabolismo en el proceso de inactivación de los radicales O2.- por acción de
la enzima superóxido dismutasa que es dependiente de Mn (II) (Daly et al., 2004). En nuestro estudio M. radiotolerans muestra ser una especie catalasa positiva de reacción rápida, lo cual podría estar relacionado con la cantidad de betacaroteno observada en las colonias (colonias con pigmentación intensa), por el contrario, la especie R. kroppenstedtii
se comporta como una especie catalasa positiva de reacción lenta, lo cual puede estar relacionada con la baja producción de betacarotenos (colonias con pigmentación tenue), la relación entre los pigmentos y la producción de catalasas fue estudiada por Ondarza (2017), ya que ambos mecanismos son activados para disminuir los radicales libre producidos. La relación entre la resistencia a radiación y la producción de catalasa fue estudiada también en células de D. radiodurans, Daly (2012) la reportó como una bacteria con alta resistencia a radiación, por la alta actividad enzimática de la catalasa, a diferencia del género bacteriano Thermus thermophilus catalogada como sensibles a radiación y catalasa negativo.
El ADN es un componente celular que tiene la particularidad de absorber directamente la energía de los rayos UV-B y UV-C (200-280 nm), dando lugar a la alteración física de la estructura nucleotídica del ADN (Lopez-Malo y Palou, 2005). Las células con genomas mas pequeños sufren menos daño a la radiación, ya que la posibilidad de la acción de los fotones la luz UV sobre el ADN es menor en comparación con los genomas de gran tamaño (Makarova et al., 2001). En nuestro estudio, se comprobó este postulado, ya que la cepa bacteriana M. radiotolerans posee un genoma más pequeño y es la más resistente a la radición, a diferencia de la cepa bacteriana Rhodococcus sp., quien presenta un genoma de mayor tamaño y es menos resistene a la radiación (Fig. 21).
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Los resultados de homología y de alineamiento de las secuencias del segmento genético ADNr 16S de las cepas en estudio, muestran que la cepa JR1_10 es Methilobacterium radiotolerans con un 100% de similitud y que la cepa JR1_01 es Rhodococcus kroppenstedtii con un 99,2% de similiud, luego de ser comparadas con las secuencias depositadas en la base de datos NCBI. El 100% de similitud entre la cepa JR1_10 y M. radiotolerans se debe a que poseen regiones altamente conservadas en la totalidad de las secuencias nucleotídicas (Fig. 26). La no coincidencia del 100% entre la cepa JR1_01 y las secuenias depositadas en la base de datos NCBI de R. kroppenstedtii (Zenoff et al.,
2006; Dastage et al., 2014; Rasuk et al., 2017), se debe a las diferencias de nucleótidos en las posiciones 838 y 839 (Fig. 25), esta diferencia podría deberse a que las secuencias depositadas corresponden a cepas aisladas de sedimentos marinos y de lagunas, ambientes muy diferentes a nuestro lugar de estudio, el Desierto de las Pampas de la Joya, el cual presenta suelos hiperáridos (Valdivia-Silva et al., 2014), siendo la resistencia a la radiación ultravioleta la única característica común entre la cepa JR1_01 y R. kroppenstedtii. Estos resultados son corroborados en el cladograma, ya que nuestras cepas JR1_10 y JR1_01 se agrupan con los géneros bacterianos Methylobacterium y Rhodococcus, respectivamente (Fig. 27).
La resistencia de las bacterias a la radiación se debe también a un cambio en la regulación del metabolismo celular (Veyrier et al., 2011). Este cambio, según Harm (1980), puede provocar la producción de complejos antioxidantes potentes, la producción de fósforo inorgánico y pequeñas moléculas orgánicas específicas, que protegen a las proteínas intracelulares reparadoras del daño producido por la radiación ultravioleta. Otros microorganismos bioacumulan Mn (II) para protegerse (Daly et al., 2007; Shuryak and Brenner, 2009), ya que protege en forma directa a las proteínas reparadoras de daño en las células, mediante una interacción sinérgica proteína-Mn (II) (Daly, 2012). En nuestras cepas, la presencia de Mn (II) es un elemento crucial para la protección contra el estrés oxidativo intracelular, pues la concentración intracelualr en estas cepas se incrementa conforme la dosis de radiación ultravioleta es más alta.
El incremento de la concentración de manganeso intracelular de las bacterias que están sometidas a radiación ultravioleta, activan mecanismos que les permite absorver manganeso a partir del medio en que se desarollan, estos mecanismos son activados por la formación de radicales libres (Luan et al., 2014; Templeton et al., 2005; Daly, 2009). Nuestros resultados demuestran que la concentracion intracelular de Mn (II) de las
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bacteiras que no recibieron radiación UV-C (muestras control), poseen una mayor concentración de Mn (II) que una E. coli (0.65 mM), bacteria catalogada como sensible a la radiación UV-C (Posey y Gherardini, 2000). Posterior al tratamiento con diferentes dosis de UV-C, se observó que nuestras cepas R. kroppenstedtii y M. radiotolerans
incrementan sus concentraciones intracelulares de Mn (II), pudiendo llegar hasta una concentración máxima de 2,2 mM y 3.9 mM, respectivamente. Sin embargo, ninguna de las concentraciones registradas para nuestras cepas bacterianas, es mayor a la concentración registrada para D. radiodurans (5mM) (Lebowitz et al., 1976). El manganeso bivalente, según Daly et al. (2007) puede distribuirse en toda la célula y por lo tanto proporcionar una protección general contra las especies reactivas de oxígeno (ROS) generados por la radiación, ya que este mineral participa en la protección de proteínas que reparan el daño causado por la radiación ultravioleta (Giorgetti et al., 2001),
El estudio de microorganismos resistentes a radiación UV-C pertenecientes a los géneros
Metilobacterium y Rhodococcus, géneros hallados en el presente estudio, no han sido muy estudiados, dan lugar a la exploración de nuevas vías catabólicas, al descubrimeinto de enzimas claves y la optimización de las propiedades biocatalíticas, en consecuencia, la diversidad metabólica de esta clase de extremófilos es de gran interés para el sector farmacéutico, químico, ambiental y energético (Daly et al., 2007). Este tipo de microorganismos son una fuente potencial de principios activos, nuevas proteínas, de pigmentos carotenoides (4-ceto-γ-caroteno y γ-caroteno), que participan en la protección contra el daño causada por la radiación (Tebo et al., 2005).
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CONCLUSIONES
- Se aislaron 40 cepas nativas del Desierto de las Pampas de la Joya, de cuatro tipos de suelo (suelo rojizo, suelo blanquecino, suelo rojizo con presencia de rocas y de un suelo plomizo). Las características morfológicas más comunes de las cepas aisladas son su crecimiento agrupado, presencia de pigmentos, siendo estas características propias de células bacterianas resistentes a radiación ultravioleta, además se identificó 19 cepas como gram positivas y 21 cepas como gram negativas. En la caracterización bioquímica todas las cepas fueron catalasa positivas.
- Las cepas que presentaron mayor viabilidad fueron las cepas JR1_10 y la cepa
JR1_01, a una dosis de 300 J/m2 de radiación UV-C, pudiendo llegar a soportar hasta una dosis de 1000 J/m2 de radiación UV-C.
- La comparación de secuencias del segmento ADNr 16S indica que la cepa JR1_01 es
Rhodococcus kroppenstedtii y la JR1_10 es Methylobacterium radiotolerans.
- M. radiotolerans es el mejor bioacumulador de manganeso (II) (3,9 mM) en comparación de R. kroppenstedtii (2,2 mM).
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RECOMENDACIONES
Determinar la actividad enzimática de las catalasas en la reparación del daño oxidativo por radiación ultravioleta.
Realizar una caracterización bioquímica de las cepas extremófilas identificadas, para su mejor ubicación filogenética.
Profundizar un estudio de los mecanismos de reparación a nivel proteómico y su interacción con el manganeso.
Realizar un estudio genómico comparativo de las bacterias extremófilas, para la diferenciación de la reparación a nivel molecular.
Generar investigaciones aplicadas a escala industrial con las bacterias extremófilas estudiadas.
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