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Se identificaron taxonómicamente las cepas C1, C4 y C7. Las secuencias del ADNr 16S obtenidas mostraron que la cepa C1 tuvo un 99% de similitud con Cellulosimocrobium sp. NEAU-Z02 (N° de acceso HM623867.1); la cepa C4 tuvo 97% de semejanza con Bacillus pumilus strain UFV-E34 (N° de acceso EU407552.1); y para la cepa C7 se encontró 99% de similitud con Stenotrophomonas sp. CK6 (N° de acceso AJ870967.1).

4.4 Discusión

Los análisis moleculares de las comunidades ambientales han revelado que la fracción cultivable representa <1% del número total de especies procariotas presentes en cualquier muestra dada [151]. En general se considera que el aislamiento y la caracterización de bacterias desnitrificantes basado en sus capacidades de reducción de N2O [152] se ven

obstaculizados por el sesgo que tienen las técnicas dependientes de cultivo y el gran esfuerzo manual, debido al hecho de que las bacterias desnitrificantes representan un bajo porcentaje de las bacterias totales [90]. En esta tesis, el procedimiento desarrollado para el aislamiento de microorganismos desnitrificantes de suelos semiáridos resultó exitoso, permitiendo obtener colonias aisladas y puras. Es un método relativamente rápido, que tiene la ventaja de continuar el aislamiento desde las microplacas en las que se determinó el NMP. No son necesarios en todos los pasos los productos de anaerobiosis, que resultan costosos y muchas veces difíciles de obtener; y la capacidad para desnitrificar se confirma mediante el uso de herramientas moleculares.

El 57,9 % de los aislamientos obtenidos en esta primera instancia provenían de suelos bajo LC, y el 56,1 % de suelos pastoreados. De las cepas confirmadas como desnitrificadoras (por presencia de los genes nirK y nosZ) más del 60% procedían de muestras de suelos que estaban bajo LC, y más de la mitad (53,13 %) procedían de muestras pastoreadas. Sin embargo, la procedencia de los aislamientos no es traducible a ningún término de diversidad o abundancia; ya que las técnicas dependientes de cultivo, a pesar de ser importantes en la investigación de la ecología microbiana de ambientes

naturales y antropogénicos impactados, pueden conducir a una visión no representativa de las poblaciones microbianas [151, 153].

El 44 % de las cepas presentaron solo el gen nirK (con un fragmento que varió entre 505,5-525,5 bp), por lo que se denominaron “desnitrificadoras parciales”. Esta clasificación incluye bacterias que contienen al menos una pero no todas las óxido nitrógeno reductasas productoras de gases requeridas para la desnitrificación [52]. En algunos casos, la presencia de solo una reductasa puede ser claro, por ejemplo, la óxido nítrico reductasa puede jugar un papel en la mitigación de la toxicidad por NO [52, 154]. En otros casos, la exclusividad de una reductasa puede sugerir que no esté estrictamente acoplada a la desnitrificación, por ejemplo, en aislamientos con genes que solo codifican una proteína con NirK [155]. El papel de esta proteína no se ha definido, pero el trabajo previo en un aislamiento de Rhizobium sugiere que podría estar involucrado en la desintoxicación de metales [156], [157]. Roco y col. [155] afirman que la ocurrencia común de desnitrificadores parciales que encontraron entre los organismos secuenciados en las bases de datos públicas, es consistente con la idea de que solo se mantendrán aquellos genes que brindan un beneficio, y que los genes no esenciales se perderán con el tiempo, probablemente como consecuencia de cambios en las condiciones ambientales.

El conocimiento de la ecología de las bacterias reductoras de N2O es de crucial

importancia para comprender mejor los factores que gobiernan los flujos de N2O del medio

ambiente, en especial de los suelos. En este estudio, se logró en el 56 % de los aislamientos la amplificación por PCR del gen nosZ. Se aplicó un protocolo de PCR con gradiente de temperatura, técnica con la cual se aumentó la especificidad, sensibilidad y rendimiento [158]. La optimización de este protocolo (Capítulo 3), sugiere la baja especificidad de la temperatura de hibridación propuesta por estos autores, aunque debe considerarse que los resultados obtenidos en estudios de diversidad basados en PCR, están fuertemente influenciados por la elección inicial del conjunto de cebadores. Debido a la completa falta de conocimientos bioquímicos y genéticos de la etapa de reducción de óxido nitroso en bacterias Gram positivas, los cebadores nosZ existentes se limitan al gen nosZ de Proteobacteriaceae [39]. En este estudio, a pesar de que se logró amplificar el gen en los aislamientos y las cepas de referencia, no se encontró coincidencia generalizada en el tamaño del fragmento, el cual varió entre 251-289 bp. Esto parece indicar que hay variación

en la secuencia amplificada del gen nosZ en los aislamientos obtenidos, y concuerda con la bibliografía referida al tema, que indica que existe una alta biodiversidad de este gen [90, 159]. En particular para suelos agrícolas, se han encontrado cambios en la diversidad de la comunidad desnitrificadora en suelos bajo labranza convencional, respecto a suelos nunca labrados [160].

El estudio del ITS arrojó variados patrones de bandas para los distintos aislamientos indicando diferencias en el número de copias del operón ribosómico. Algunas cepas coincidieron en el número y tamaño de las bandas, lo que podría indicar que se trata de una misma cepa. Esta heterogeneidad, que se puede encontrar tanto en términos de la cantidad como en la longitud de los espaciadores, permite la tipificación e identificación de bacterias [148], sin embargo la variación intragenómica del ITS puede llevar a una sobreestimación del número de bacterias funcionalmente diferentes, ya que la diversidad genética a nivel de cepa ha sido definitivamente ligada a la diversidad de ecotipos bacterianos. En particular, la heterogeneidad intragenómica en la longitud del ITS tiene el potencial de sesgar las estimaciones de la diversidad que se basan únicamente en las técnicas de fingerprinting o huella de ADN. Por lo tanto, evaluar con precisión la microdiversidad bacteriana utilizando técnicas basadas en ITS, requiere una comprensión de cómo esta región se desarrolla en distintos taxones bacterianos [161].

La evaluación de utilización de SC mostró patrones variados entre las cepas evaluadas. El análisis del dendrograma y los resultados obtenidos con ACP, muestra que existen marcadas diferencias entre las cepas aisladas de un mismo tipo de suelo. La pertenencia a un mismo grupo por la similitud en el consumo de SC, no indica necesariamente que estén relacionados filogenéticamente. En este tipo de estudio, hay que destacar que no se trata de evaluar la utilización de sustratos individuales, sino el cambio en el patrón de utilización de sustrato [46]. Además CLPP no es un método independiente de cultivo, sino más bien está sesgado hacia las especies de crecimiento rápido, fácilmente cultivables [29]. Por lo tanto, ya sea para estudios a nivel de cepa como a nivel de comunidad, CLPP no debe ser visto como un método independiente, sino como un método altamente complementario a otros enfoques.

Finalmente, en este estudio se conoció la identidad de los tres aislamientos seleccionados. Las secuencias del gen 16 rRNA de las cepas desnitrificantes mostraron una

amplia diversidad bacteriana, ubicándose en tres grandes grupos taxonómicos: Proteobacteria; Firmicutes, bacterias Gram positivas con bajo contenido de C+G y; Actinobacteria, Gram positivas con alto contenido de C+G. De los tres géneros encontrados, el hábitat primario de Bacillus es el suelo; las especies de Stenotrophomonas pueden ser ubicuas en el medio ambiente, aunque el suelo y las plantas son su principal reservorio ambiental [162]; y también se han encontrado especies de Cellulosimicrobium características de suelo [163]. Además, estos géneros han sido estudiados por su capacidad reductora de nitrato y desnitrificante [164].