IN MIYAKO CITY
8.4.5 Spatial planning measures to build resilience
10.1.
Preparación de la muestra
Para los ensayos realizados se escogió el final de la fase de crecimiento exponencial como momento óptimo para los posteriores estudios de expresión. El cultivo se preparó siguiendo el siguiente procedimiento:
i. Partir de un cultivo O/N en placa de LB, con los suplementos antibióticos requeridos en cada caso
ii. Preparar una suspensión de la placa en 1 ml de LB
iii. Añadir a una botella con 15 ml de LB una cantidad de suspensión tal para tener una DO550 de entre 0,04 y 0,06
iv. Incubar el cultivo en agitación a 37º C hasta que llegue a una DO550 de
entre 0,9 y 1
v. Dividir cada cultivo en 2 tubos para centrífuga con 5 ml cada uno vi. Centrifugar el cultivo a 8.300 g durante 10 min a 4º C
vii. Descartar el sobrenadante por decantación. Dejar los pellets en hielo hasta el momento de su procesado
En el caso de los cultivos tratados con quelante se añadió el suplemento de EDTA a una concentración final de 1,5 mM a la botella con los 15 ml de LB y se dejó 30 min en agitación a 37º C antes de añadir las células.
10.2.
Extracción de RNA
Para evitar la degradación del RNA, todo el material utilizado fue libre de RNasas. Las soluciones preparadas se trataron con DEPC (dietil pirocarbonato) siguiendo las instrucciones del fabricante (Sigma). El material de vidrio se trató a 180º C durante un mínimo de 3 h y todo el material fungible utilizado estaba libre de RNasas.
Se procedió a la extracción del RNA total de cada pellet de 5 ml utilizando el kit SV Total RNA Isolation System (Promega):
i. Resuspender cada pellet en 100 μl de Buffer TE RNasa-free (Sigma) con 50 mg/ml de lisozima (Sigma)
ii. Incubar 10 min a temperatura ambiente
iv. Añadir 350 μl de la solución RNA dilution. Mezclar suavemente por inversión
v. Calentar a 70º C durante 3 min
vi. Centrifugar 10 min a máxima velocidad. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo
vii. Añadir 200 μl de etanol 95% y mezclar con la pipeta
viii. Transferir todo el volumen a una Spin Column Assembly y centrifugar 1 min a 12.000 g. Descartar el eluido
ix. Añadir 600 μl de Wash Solution. Centrifugar 1 min a 12.000 g. Descartar el eluido
x. Añadir 50 μl de DNasa mix (preparada previamente: 40 μl de Yellow Core Buffer, 5 μl de MnCl2 y 5 μl de DNasaI) free directamente a la membrana
de la columna
xi. Incubar 15 min a temperatura ambiente
xii. Añadir 200 μl de DNasa Stop Solution y centrifugar 1 min a 12.000 g. Descartar el eluido
xiii. Añadir 600 μl de Wash Solution y centrifugar 1 min a 12.000 g. Descartar el eluido
xiv. Añadir 250 μl de Wash Solution y centrifugar 2 min a 12.000 g
xv. Transferir la columna en tubos eppendorf, añadir 100 μl de Nucleasa-free Water a la membrana y esperar 1 min
xvi. Centrifugar 2 min a 12.000 g
xvii. Cuantificar las muestras mediante el espectofotómetro GeneQuant y las cargar en un gel de RNA para comprobar el estado del RNA
10.3.
Eliminación del DNA
Para eliminar cualquier resto de DNA presente en la extracción de RNA se procedió al tratamiento con DNasa con el kit Turbo DNA-freeTM (Ambion). Para cada extracción de RNA (90 μl aproximadamente):
i. Añadir 10 μl de 10X Reaction Buffer y 4 μl del enzima TURBO DNaseTM ii. Incubar a 37º C durante 30-45 min
iii. Añadir de nuevo 3 μl de enzima e incubar 30 min más
iv. Para inactivar la reacción añadir 10 μl de DNase Inactivation Reagent y dejar a temperatura ambiente 2 min, resuspender el contenido de vez en cuando
vi. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo sin llevarse el precipitado blanco que forma el inhibidor
vii. Repetir los pasos v y vi dos veces más para asegurarse de que no queda nada de inhibidor ya que podría interferir en los pasos posteriores
viii. Cuantificar de nuevo las muestras con el GeneQuant, cargarlas en un gel de agarosa y hacer una PCR para comprobar que no hay DNA cromosómico en las extracciones
10.4.
Purificación y concentración del RNA
Para eliminar cualquier resto de inhibidor de la DNasa que haya podido quedar, y concentrar las muestras de RNA se utilizó el protocolo de Clean-up del kit RNeasy Mini Kit (Quiagen):
i. Juntar las dos extracciones de RNA que provienen de la misma muestra (200 μl)
ii. Añadir 350 μl de Buffer RLT, mezclar suavemente con la micropipeta iii. Añadir 250 μl de Etanol absoluto frío. Mezclar suavemente con la
micropipeta
iv. Transferir toda la mezcla (800 μl) en una columna montada sobre un tubo de elución
v. Centrifugar 15 s a 8.000 g. Descartar el eluido vi. Añadir 500 μl de Buffer RPE
vii. Centrifugar 15 s a 8000 g. Descartar el eluido viii. Añadir 500 μl más de RPE
ix. Centrifugar 2 min a 8000 g. Descartar el eluido
x. Opcionalmente se puede centrifugar 1 min más para asegurar que no queda RPE
xi. Transferir la columna a un tubo eppendorf nuevo
xii. Eluir la columna añadiendo la cantidad de MQ RNasa-free para obtener 1,5 – 2 μg/μl de RNA
xiii. Cuantificar el RNA, cargarlo en un gel de agarosa y hacer una PCR para comprobar que no hay DNA
xiv. Preparar una alícuota (unos 2 μl) que esté a 300 – 500 ng/μl para comprobar el estado del RNA con el Bioanalyzer
10.5.
Obtención del cDNA
10.5.1.Retrotranscripción
Se procedió a la obtención de cDNA a partir del RNA total mediante una retrotranscripción utilizando el kit SuperScriptTM III Reverse Transcriptase (Invitrogen). Se llevaron a cabo 3 reacciones para cada muestra de RNA:
i. Combinar en un tubo: 15 μg RNA; 150 ng de Random Primers (Invitrogen); 3 μl de 10mM dNTP mix (Invitrogen); agua RNasa-free hasta un volumen final de 22 μl
ii. Incubar la mezcla en un termociclador a 65º C durante 5 min y mantener a 4º C
iii. Añadir a la mezcla anterior: 7 μl de 5X First-Strand Buffer; 3.5 μl de DTT 0,1M; 200 U de SuperScript III RT; 40 U de RNaseOUT (Invitrogen); y 0.5 μl de agua RNasa-free
iv. Mezclar e incubar en el termociclador: 10 min a 25º C, 50 min a 50º C y 5 min a 85º C. Conservar a 4º C
v. Añadir 3 U de RNase-H (Epicentre) vi. Incubar a 37º C 10 min
10.5.2.Purificación del cDNA
Tenemos 3 reacciones de retrotranscripción que provienen de un mismo RNA. En el siguiente paso el cDNA se purifica y se concentra juntando las 3 reacciones en una columna de purificación del kit QIAquick PCR Purification (Quiagen):
i. Añadir 5 volúmenes (176,5 µl) de Buffer PB a cada una de las 3 reacciones ii. Montar las columnas dentro de los tubos recolectores
iii. Recoger las 3 reacciones en una sola columna y centrifugar 1 min a 9.700 g iv. Descartar el eluido
v. Añadir 750 µl de Buffer PE y centrifugar 1 min a 9.700 g vi. Descartar el eluido. Volver a centrifugar 1 min a 9.700 g vii. Poner la columna en un tubo eppendorf nuevo
viii. Eluir el cDNA añadiendo 50µl de H2O RNase-free a la membrana de la
columna. Dejar reposar 1 min y centrifugar 1 min a 9.700 g
ix. Cuantificar el cDNA con el GeneQuant y conservar a -80º C hasta el momento de su uso
10.5.3.Obtención del DNA genómico 10.5.3.1. Extracción de DNA genómico
Para la extracción de DNA genómico de la cepa SV5015 de S. Typhimurium se utilizó el kit Genomic DNA (Quiagen) (Genomic DNA buffer set y las columnas de purificación Genomic-tip 100/G):
i. Partir de un cultivo de 6 ml en fase exponencial
ii. Centrifugar durante 10 min a 9.000 g a 4º C. Descartar el sobrenadante iii. Para cada extracción preparamos las siguientes soluciones:
a. Buffer B1+RNasa: Añadir 35 µl de solución RNAsa A (20 mg/ml) a 3,5 ml de Buffer B1. Quedando a una concentración final de 200 µg/ml
b. Stock de lisozima: disolver la lisozima a una concentración final de 100 mg/ml
c. Stock de proteinasa K: Preparar una solución de proteinasa K a concentración de 20 mg/ml
iv. Resuspender el pellet en 3,5 ml de Buffer B1+RNAsa vorteando a máxima potencia. Es importante obtener una solución homogénea para incrementar la eficiencia de lisis de las bacterias
v. Añadir 80 µl de stock de lisozima y 45 µl de stock de proteinasa K vi. Incubar a 37º C durante 30 min
vii. Añadir 1,2 ml de Buffer B2 y mezclar por inversión varias veces. Incubar a 50º C durante 30 min
viii. Centrifugar la muestra durante 10 min a 9.000 g a 4º C
ix. Mientras se centrifuga la muestra, equilibrar una columna de QUIAGEN Genomic-tip 100/G con 4 ml de Buffer QBT
x. Colocar la columna sobre un tubo, añadir los 4 ml de Buffer QBT y permitir que éstos pasen a través de la columna por gravedad
xi. Recuperar el sobrenadante de la muestra del paso viii y vortear durante 10 s
xii. Añadir el sobrenadante a la columna equilibrada y permitir que vaya pasando por gravedad
xiii. Lavar la columna con 7,5 ml de Buffer QC xiv. Repetir el paso xiii
xv. Eluir el DNA en 5 ml de Buffer QF atemperado a 50º C, recogiendo el eluido en un tubo
xvi. Añadir 3,5 ml (0,7 volúmenes) de isopropanol a temperatura ambiente xvii. Agitar por inversión el tubo de entre 10-20 veces
xviii. Centrifugar inmediatamente a 12.000 g durante 15 min a 4º C
xix. Eliminar el sobrenadante y limpiar el pellet con 2 ml de etanol 70% frío. Vortear brevemente i centrifugar a 12.000 g durante 10 minutos a 4º C xx. Eliminar el sobrenadante y secar al aire durante 5-10 min
xxi. Resuspender con 200 µl de MQ xxii. Incubar a 55º C durante 1-2h
xxiii. Determinar la concentración en el GeneQuant, cargar en un gel de agarosa al 0,4 % y conservar a -80º C hasta el momento de su uso
10.5.3.2. Fragmentación del DNA genómico
Juntamos 3 extracciones de DNA, obteniendo un volumen final de 600 μl. El DNA se fragmenta por sonicación durante 1’ a 50 W en ciclos de 0,3 s, utilizando un homogenizador ultrasónico Braun Labsonic U (B.Biotech) con una sonda pequeña de titanio (40 T).
La fragmentación se chequea cargando la muestra en un gel de agarosa al 1%
10.5.4.Marcaje de las muestras de cDNA y gDNA
Para marcar las muestras de cDNA y gDNA se utiliza el kit BioPrime® Plus Array CGH Indirect Genomic Labeling System (Invitrogen). Este sistema utiliza un mutante del fragmento Klenow de la DNA polimerasa I (exo-Klenow), aminohexilacrilamido-dUTPs (aha-dUTP), y fluoróforos Alexa Fluor® (Alexa Fluor® 555 succinimidil éster y Alexa Fluor® 647 succinimidil éster) para marcar las muestras de DNA diferencialmente.
10.5.4.1. Amplificación y marcaje del cDNA y el gDNA
El primer paso permite la hibridación del DNA con los random primers, seguido de una extensión mediante una reacción de polimerización usando el enzima exo- klenow. Así se obtiene una amplificación de 7 a 10 veces el material de partida. Para cada reacción: