Spatial variations in waves, currents and turbidity 93

En parásitos que alternan entre hospederos invertebrados y vertebrados, las fluctuaciones drásticas de temperatura son una parte rutinaria del ciclo de vida. La presencia de proteínas de estrés se ha demostrado en varios de dichos organismos, incluidos los miembros de los géneros Trypanosoma y Leishmania.

Como tal, la adaptación de estos organismos para la supervivencia durante un amplio intervalo de temperatura, sugiere que la respuesta al choque térmico juega un papel importante en la supervivencia del parásito y su diferenciación (218, 219).

Entre las HSP, la HSP70 es la más conservada en secuencia y función (219). Las proteínas HSP70 son componentes centrales de la red celular de chaperonas moleculares, catalizadores del plegamiento de proteínas, replegamiento de proteínas mal plegadas y agregadas, estas proteínas también previenen la agregación de proteínas que serán insertadas en membranas, contribuyen con el transporte de proteínas hacia organelos como la mitocondria y participan en el control de la actividad de proteínas reguladoras como la ADNasa activada por caspasas (CAD) (220-228).

La HSP70 ejerce su función en el plegamiento de proteínas mediante la asociación transitoria de su dominio de unión al sustrato con segmentos cortos de péptidos hidrófobos de las proteínas sustrato. El ciclo de unión y de liberación del sustrato es accionado por la conmutación de la proteína HSP70 entre el estado de baja afinidad (unida a ATP) y el estado de alta afinidad (unida a ADP). Por lo tanto, la unión de ATP y la hidrólisis son esenciales in vitro e in vivo para la actividad

chaperona de las proteínas HSP70. Este ciclo ATPasa es controlado por co- chaperonas de la familia de proteínas de dominio J, que dirigen la HSP70 a sus sustratos y por factores de intercambio de nucleótidos, que determinan el tiempo de vida del complejo HSP70-sustrato (229).

54 Debido a que la HSP70 es abundantemente secretada al medio extracelular, también induce una fuerte respuesta inmune humoral y celular, por lo cual se considera también como un inmunomodulador del sistema inmune del hospedero (230).

Interesantemente, en relación a los genes HSP70 de Leishmania, se han

descrito en L. (L.) infantum, L. (L.) major, L. tropica, L. (L.) mexicana y L. (L.) amazonensis (14, 231) dos tipos de genes denominados HSP70-I y HSP70-II, que

comparten la región 5´ UTR y la región codificante, pero que difieren en su 3´ UTR. En general, estos genes están dispuestos en una única agrupación

genómica que contiene cinco o seis copias de los genes HSP70-I, seguidos de

una copia del gen HSP70-II. En L. (L.) infantum, se ha demostrado que, mientras

que el ARNm del gen HSP70-I se acumula en respuesta al choque térmico y se

traduce tanto a 26 como a 37°C, el ARNm del gen HSP70-II no muestra una

acumulación dependiente de la temperatura, pero se traduce preferencialmente a temperaturas de choque térmico (231). La estricta conservación del arreglo de genes HSP70 en todas las especies de Leishmania analizadas hasta ahora (14)

sugiere que este tipo de disposición debe tener un papel funcional importante.

La proteína HSP70 de Leishmania participa en otros procesos celulares de

interés. Es así como, se ha observado sobreexpresión de la proteína HSP70 en aislados de varias especies de Leishmania resistentes a antimonio, lo que indica

que este aumento del nivel de expresión de la proteína confiere protección contra los antimoniales (232-235). Estudios recientes también han demostrado que el bloqueo de la expresión del gen HSP70 a nivel de ARNm con oligonucleótidos

antisentido induce muerte celular programada y causa defectos en el ciclo celular (236). Por otra parte, la interrupción del gen HSP70-II de L. (L.) infantum causa un

efecto perjudicial sobre el crecimiento y la morfología de los promastigotes en la fase estacionaria de mantenimiento, sobre la progresión del ciclo celular en la transición de la fase G2/M en ambos estadios del parásito, por lo tanto, la virulencia de este en ratones también se ve afectada (21). Además, ratones

55 BALB/C, ratones inmunodeficientes y hamsters, no desarrollan ningún signo de patología, tras ser inoculados con parásitos mutantes carentes del gen HSP70-II

(22).

En general, los anteriores datos ponen de relieve el papel fundamental que desempeñan las proteínas HSP70 de Leishmania en la virulencia y supervivencia

del parásito, señalando a este gen o los factores que regulan su expresión como blancos prometedores para intervenciones terapéuticas.

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4.5 -tubulinas

Las tubulinas son proteínas fundamentales en la conformación del cito-esqueleto, de la maquinaria de división celular y de los orgánulos responsables de la motilidad del parásito. También intervienen en el transporte intracelular y el control de la traducción (237, 238). Existe una gran familia de proteínas tubulinas, sin embargo, el heterodímero alfa/beta (/), es el principal constituyente de los microtúbulos de los kinetoplástidos (239).

En microorganismos unicelulares como Leishmania, la forma y motilidad de

las células son particularmente relevantes ya que muchos aspectos de su biología como la infectividad y la transmisión dependen de éstas (238). Por lo anterior, el estudio de la expresión de las proteínas que conforman el citoesqueleto y participan en la motilidad del parásito como las -tubulinas, es de gran interés. Adicionalmente, dado que las -tubulinas son el blanco de acción de varios medicamentos usados para tratar el cáncer, las infecciones por hongos y por helmintos (240, 241), estas proteínas también han sido consideradas para el desarrollo de fármacos anti-Leishmaniales.

En tripanosomas, los genes  y -tubulina se organizan de forma alterna en

un solo tándem. Por el contrario en Leishmania, estos genes forman agrupaciones

separadas, ubicadas en distintos cromosomas (242). La organización genómica de los genes tubulina se ha analizado en distintas especies de Leishmania,

mostrando la existencia de múltiples copias, dispuestas en tándem y algunas dispersas en el genoma (242, 243). Por ejemplo, los genes -tubulina en L. enriettii se organizan en un tándem de 15 copias con una unidad de repetición de

2,2 kb (243). El análisis de los cromosomas de L. enriettii mediante electroforesis

de campo pulsado (PFE) demostró diferencias en el tamaño de los cromosomas que contienen estos genes (244). Así, mediante análisis de restricción de las regiones flanqueantes y el análisis del tamaño de los tándem en los geles de PFE con los cromosomas digeridos, se determinó que el tándem de mayor tamaño, se

57 sitúa en el cromosoma más grande, con alrededor de 18 a 20 copias del gen - tubulina, mientras que el otro tándem, tiene de 10 a 11 copias (245). En L. (L.) major, se estimó la presencia de una agrupación de 10-12 copias en el

cromosoma 13 del parásito (136, 246). En L. (L.) donovani, también se determinó

la presencia de un tándem con múltiples copias de los genes -tubulina (247). Por

su parte, el genoma de L. (L.) infantum presenta dos locus para los genes - tubulina, uno, hacia el extremo 5´ del cromosoma con una sola copia y el otro,

hacia al extremo 3´ con una copia completa y una copia parcial. Sin embargo, los locus de los genes -tubulina en el genoma reportado de L. (V.) braziliensis

presentan vacíos en las secuencias y el ensamblaje, que no han permitido confirmar la organización genómica de éstos (146).

En cuanto a la expresión de estos genes en Leishmania, estudios clásicos

han demostrado que los promastigotes sintetizan más tubulinas ( y  tubulinas) que los amastigotes y que este cambio biosintético de las tubulinas se correlaciona con el cambio morfológico sufrido por el flagelo y el citoesqueleto durante la transformación de promastigote a amastigotes (247-250). Estudios dirigidos a descubrir la regulación responsable de la expresión diferencial de los genes codificantes para las tubulinas en Leishmania, revelaron que mientras en L. enriettii la regulación depende de la estabilidad de los ARNm (251), en L. (L.) mexicana obedece a mecanismos de actividad traduccional (252, 253). En relación

a T. cruzi, diversos estudios sugieren la existencia de un mecanismo

autorregulatorio responsable de la acumulación diferencial del ARNm de las tubulinas (249, 250). No obstante, el mecanismo responsable de la regulación de la expresión de los genes -tubulina en L. (V.) braziliensis aún no se comprende

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4.6 Subunidad 8 de la nicotinamida adenín dinucleótido ubiquinona