Spatial Weights Matrices for Central and Remote Gasoline Stations

Se clasificó a los animales inoculados en animales de alta o baja carga proviral, según el nivel de la misma determinado al final del ensayo. Aquellos animales que presentaron un valor igual o menor a 20 copias de provirus/30ng de DNA a los 178 dpi fueron clasificados como animales de baja carga proviral (BCP). En el caso de los animales en los que no se pudo obtener muestra en ese tiempo, definimos un nivel máximo de 200 copias de provirus/30ng de DNA a los 88 dpi. Por lo tanto, los animales portadores de más de 20 copias de provirus a los 178 dpi o más de 200 copias de provirus a los 88 dpi fueron clasificados como animales de alta carga proviral (ACP).

Se analizó el efecto de la infección con M. bovis sobre el perfil de infección con BLV. No se observó asociación significativa entre la infección con la micobacteria y el perfil de infección establecido en los animales (p=0,3413).

La tabla 4.4 muestra la distribución de los animales inoculados de acuerdo a su genética BoLA DRB3 y el perfil de infección con BLV. El perfil esperado de BCP se obtuvo en 6 de los 7 animales inoculados portadores del alelo *0902, asociado a resistencia. Asimismo los 6 animales portadores del alelo *1501, asociado a susceptibilidad, lograron el perfil esperado de ACP. La asociación entre el perfil de infección y la genética BoLA DRB3 fue significativa (p<0,01).

Grupo genético

Perfil de infección *0902/N *1501/N N/N

ACP 1 6 4

BCP 6 0 2

Tabla 4.4: Distribución de los animales inoculados con BLV de acuerdo al perfil de infección establecido a los 88 o 178 dpi y la genética BoLA DRB3.

En la figura 4.8 se graficó la cinética de la carga proviral en los animales inoculados, agrupados de acuerdo al perfil de infección logrado. La cinética del provirus difirió entre los animales de ACP y BCP a partir de los 38 dpi. Los animales con ACP presentaron tres aumentos en la carga proviral, a los 30, a los 45 y a los 88 dpi; mientras que el grupo de BCP sólo presentó un pico a los 30 dpi, y a partir de este máximo, que coincide con el momento de sero-conversión, la carga proviral inició un descenso continuo hasta niveles indetectables a los 178 dpi. Se calculó el intervalo del 95% de confianza para la media de la carga proviral para cada perfil de infección a los 88 y 178 dpi como se muestra en la tabla 4.5. La carga proviral fue en promedio 175 veces mayor en animales de ACP con respecto a BCP a los 88 días. A los 178 días los animales de BCP presentaron valores de carga indetectable por qPCR mientras que el promedio para los animales con ACP fue de 3117,4 copias.

Figura 4.8: Carga proviral a lo largo del tiempo en los animales inoculados agrupados según los perfiles de infección. Las copias de provirus se determinaron por qPCR CV y se expresaron como copias de provirus/30ng de DNA total extraído a partir de leucocitos de sangre periférica.

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 co p ia s d e p ro v ir u s / 3 0 n g d e D N A

días post - inoculación

BCP ACP

Días post – inoculación

Perfil de infección

ACP BCP

88 6964,9  2516,9 36,3  55

178 3117,4  1692,8 0  0

Tabla 4.5: Intervalo de confianza de la carga proviral para cada perfil de infección a los 88 y 178 dpi. Se consideró un =0,05 para la determinación del intervalo de confianza de la media de las copias de provirus/30ng de DNA total determinado por qPCR CV.

La cinética de los recuentos leucocitarios y linfocitarios de los animales agrupados según el perfil de infección se muestra en las figuras 4.9.a y 4.9.b respectivamente. A partir de los 7 días post-inoculación hasta el final del experimento, se observaron mayores recuentos promedio de leucocitos y linfocitos en los animales con ACP respecto de los animales con BCP.

a) 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 le u co ci to s to ta le s / u l d e sa n g re

días post - inoculación

BCP ACP

Figura 4.9: Cinética de los recuentos leucocitarios y linfocitarios en animales agrupados según el perfil de infección con BLV. a) recuentos leucocitarios; b) recuentos linfocitarios. 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 li n fo ci to s to ta le s / u l d e sa n g re

días post - inoculación

BCP ACP

Finalmente se analizó la expresión in vitro de p24 según el perfil de infección. En la figura 4.10 se muestra el logaritmo de la expresión de p24 a lo largo del tiempo en cultivos de células mononucleares estimuladas con Con A. El patrón de expresión de p24 fue similar hasta los 30 dpi presentando en este tiempo post-inoculación el máximo valor observado para ambos perfiles. Luego, los animales de BCP presentaron un descenso más abrupto en la expresión de esta proteína viral que los animales de ACP. El modelo propuesto para analizar la dependencia del valor de expresión in vitro según los perfiles a lo largo del tiempo, presentó interacción significativa (p=0,0124) entre el tiempo y el grupo perfil de infección. El valor de expresión de p24 difirió significativamente a los 61 dpi entre los animales de BCP y ACP (p<0,05).

Figura 4.10: Expresión in vitro de p24 a lo largo del tiempo en los animales agrupados según el perfil de carga proviral. Se graficó en escala logarítmica la expresión de p24 obtenida en células mononucleares cultivadas con Con A. Dentro de cada perfil se encontró un efecto significativo del tiempo (p<0,05). Dentro del perfil de ACP se encontraron diferencias significativas entre los 7 y 30 dpi mientras que dentro del perfil de BCP las diferencias fueron significativas entre los 7 y 30 dpi, entre los 30 y 38 dpi y entre los 45 y 61 dpi.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 lo g n g d e p 2 4 / m g d e p ro te ín a

días post - inoculación

BCP ACP

4.3. DISCUSIÓN

El ensayo de inoculación experimental permitió reproducir los perfiles de ACP y BCP en terneros Holando Argentino portadores de los alelos BoLA DRB3*1501 y BoLA DRB3*0902 respectivamente. Este trabajo constituye el primer estudio acerca de la cinética del provirus, los recuentos leucocitarios y linfocitarios totales, la cinética del título de anticuerpos anti-gp51 y la expresión de p24 en animales que desarrollan alta y baja carga viral.

Como consecuencia del resultado positivo a la prueba de tuberculina, 5 animales del ensayo debieron ser enviados a faena como lo dispone la reglamentación vigente en Argentina. Este hecho originó un imprevisto en nuestro ensayo, dado que sumó una nueva variable a incluir en los análisis y nos impidió obtener las muestras correspondientes a los 6 meses post- inoculación en los animales descartados. El efecto de M. bovis sobre el desarrollo de la infección con BLV y la respuesta inmune contra el virus no se ha estudiado previamente. Enla bibliografía consultada, sólo se encuentra un reporte de caso del año 2009 en Estados Unidos, que describe la fisiopatología de la co-infección por ambos patógenos en un bovino (Fitzgerald et al., 2009). En nuestro ensayo, no se encontró asociación significativa entre la infección por M. bovis y el genotipo BoLA DRB3 de los animales. Además, si bien el número de animales estudiados es limitado, los parámetros virales e inmunológicos estudiados no se vieron afectados en los animales con reactividad positiva a la prueba de tuberculina. Por esta razón, todos los animales incluídos en el ensayo fueron utilizados para los análisis subsiguientes, eliminándose sólo uno debido a que presentaba ambos alelos de interés en heterocigosis.

A diferencia de lo observado en el ensayo piloto, en esta experiencia con mayor cantidad de animales, todos los portadores del alelo BoLA DRB3*1501 desarrollaron ACP. De la misma manera, una alta proporción de los animales portadores del alelo asociado a resistencia desarrollaron BCP. Tal como se mostró, la asociación entre la genética BoLA DRB3 y el perfil de carga proviral resultó estadísticamente significativa. Sólo 1 animal portador del alelo BoLA DRB3*0902 desarrolló ACP. Este fenómeno se podría explicar por la alta, pero no completa, penetrancia del alelo *0902, como factor genético asociado a la resistencia a la diseminación del BLV, reportada por Juliarena y cols. (Juliarena, 2008; Juliarena et al., 2008). En nuestro ensayo un 33% de los animales portadores de alelos neutros desarrolló BCP, porcentaje similar a lo encontrado en estudios transversales (Juliarena, 2008). Los perfiles de ACP y BCP en animales naturalmente infectados fueron originalmente descriptos por investigadores de nuestro grupo (Juliarena et al., 2007) y posteriormente asociados a la genética BoLA DRB3 (Juliarena et al., 2008). Estos resultados constituyen la primer reproducción experimental del desarrollo de

perfiles de ACP y BCP.

Los niveles cuantificados de carga proviral en este ensayo fueron 10 veces superiores a los detectados en el ensayo piloto. Esta diferencia podría ser debida a la carga de provirus del inóculo, o bien a la edad y/o sexo de los animales. En relación al inóculo, en estudios previos se ha empleado un amplio rango de inóculos desde 200 a 1 x 109 leucocitos (Kono et al., 1983; Mammerickx et al., 1988; Naif et al., 1992; Ward et al., 1992; Kelly et al., 1993; Klintevall et al., 1994; Schwartz-Cornil et al., 1997). En el ensayo piloto del capítulo 3 se inocularon 2,275 x 106 leucocitos con 0,24 x 106 copias de provirus, mientras que en este segundo ensayo se inocularon 1,57 x 106 leucocitos con 2,59 x 106 copias de provirus.

Los recuentos leucocitarios y linfocitarios presentaron el mismo perfil post-inoculación en los 3 grupos genéticos. A pesar de que las diferencias no fueron significativas, los terneros portadores del alelo de resistencia presentaron los menores recuentos a lo largo del tiempo. Los valores obtenidos en estas variables son comparables a lo reportado en la bibliografía (Usui et al., 2007; Pomier et al., 2008).

El tiempo a la seroconversión de los terneros fue similar en ambos grupos genéticos, y los valores coinciden con lo descripto en la bibliografía (Cockerell et al., 1986; Radke et al., 1990; Willems et al., 1992b; Kelly et al., 1993; Klintevall et al., 1994; Pomier et al., 2008).Los títulos de anticuerpos anti-gp51 se mantuvieron altos a lo largo del tiempo, indicativos de una estimulación constante del sistema inmune, como se observó en el ensayo piloto, y coincidente con lo reportado en la bibliografía (Revisado por (Florins et al., 2007a)). A partir de los 45 dpi, se observó que los títulos de anticuerpos evolucionaron en forma distinta en los 3 grupos genéticos, manteniéndose los títulos de los animales con genética *0902 en promedio inferiores a los otros dos grupos genéticos estudiados. Este resultado es consistente con la correlación positiva entre los títulos de anticuerpos antivirales y la carga viral descripta por Juliarena y cols. (Juliarena, 2008).

Se detectó expresión de la proteína p24 en cultivos celulares estimulados in vitro de los terneros inoculados, sin embargo animales BoLA DRB3*0902 y BoLA DRB3*1501 presentaron la misma capacidad de expresar esta proteína viral.

El perfil de baja carga proviral fue descripto originalmente en animales naturalmente infectados, en los cuales la cantidad de provirus en sangre periférica se determinó mediante una PCR semicuantitativa. Utilizando ese método los animales que tenían provirus indetectable, o con menos de 100 copias/ug de DNA en 3 muestras consecutivas obtenidas con intervalo de 6 meses, fueron considerados de BCP (Juliarena et al., 2007). Este criterio fue originalmente establecido para asegurar que el perfil de BCP era estable, y no transitorio como podría ocurrir

en cercanía del parto o como consecuencia de una infección reciente. Dado que en esta tesis se utilizó la qPCR CV como método de cuantificación absoluta del provirus, fue necesario establecer un nuevo criterio para definir el perfil de BCP. El análisis en paralelo de muestras bajo los 2 métodos (PCR semicuantitativa versus qPCR CV) no nos permitió establecer equivalencias entre ellos (no mostrado). Posiblemente esto sea debido a la calidad del DNA y a diferencias en la performance de las PCRs. El criterio de BCP definido se estableció a posteriori, en función del tiempo post-inoculación y sólo a los efectos de esta tesis. El empleo a largo plazo de la qPCR CV nos permitirá corroborar o modificar los valores de corte para definir los perfiles de infección con BLV.

Los resultados de este experimento nos permiten concluir que: 1) todos los animales, tienen la capacidad de replicar el BLV en niveles comparables, independientemente de su genética BoLA DRB3, 2) a partir del momento de manifestación de la respuesta inmunitaria adaptativa, la carga proviral comienza a definirse, manteniéndose en niveles altos, o bien disminuyendo en forma constante hasta hacerse indetectable y 3) todos los animales que progresan hacia un perfil de BCP tienen niveles de carga viral indetectable a partir de los 90 dpi.

Alvarez y cols. encontraron correlación significativa entre el nivel de carga proviral y los recuentos de leucocitos totales en vacas infectadas con BLV, y proponen que sería posible utilizar el recuento de leucocitos totales como marcador del nivel de carga proviral (Alvarez et al., 2013). En nuestro ensayo, los recuentos de leucocitos resultaron en promedio inferiores en los animales de BCP comparados con los de ACP, sin embargo, dada la gran variación en los recuentos en cada grupo, no se puede diferenciar a los perfiles mediante este parámetro. Por lo tanto, en base a nuestros resultados, el recuento leucocitario no constituye un buen marcador del nivel de carga proviral.

Conclusiones

El estudio de la dinámica de infección con BLV en bovinos resistentes, es fundamental para comprender los mecanismos de resistencia que ponen en juego estos animales para controlar el virus. En esta tesis se desarrollaron metodologías destinadas a cuantificar el virus y a evaluar la respuesta del hospedador, como así también métodos para identificar los alelos BoLA DRB3 asociados a resistencia y susceptibilidad. Este trabajo constituye el primer estudio de dinámica de infección en bovinos portadores de genotipos definidos del gen BoLA DRB3. El ensayo de inoculación experimental nos permitió reproducir los perfiles de ACP y BCP, y aportó conocimiento acerca de cómo se establece la infección en estos grupos.

Las PCRs desarrolladas para identificar los alelos BoLA DRB3 asociados a resistencia y susceptibilidad es uno de los aportes metodológicos de mayor aplicación práctica de esta tesis. Tanto en su versión convencional como en tiempo real, estas PCR alelo específicas demostraron alta sensibilidad y especificidad. Contar con 2 opciones de técnicas para la identificación de animales portadores de los alelos de interés constituye un gran avance para los programas de control del BLV con intervención genética. Actualmente la qPCR específica para el alelo BoLA DRB3*0902 se está empleando en un programa piloto de selección genética en tambos de la provincia de Santiago del Estero, Argentina, en el marco de un proyecto de investigación y desarrollo (Juliarena et al., 2015).

El desarrollo de una PCR en tiempo real para cuantificar de manera absoluta el provirus constituye un avance metodológico comparado con la PCR semicuantitativa que se utilizó en los estudios previos de caracterización de perfiles de alta y baja carga proviral. Esta técnica nos permitió estudiar la dinámica del provirus con gran reproducibilidad, sensibilidad y especificidad. Dado que la qPCR está reemplazando poco a poco a la PCR convencional, es necesario establecer nuevos criterios basados en esta metodología para definir los perfiles de ACP y BCP. Basados en los resultados de nuestro ensayo de inoculación experimental, se establecieron parámetros arbitrarios para definir los perfiles de infección por qPCR, en función de la carga proviral y del tiempo post-inoculación. Sin embargo, creemos importante resaltar que estos criterios son provisorios, y deberán ser revisados luego del análisis de un mayor número de animales infectados, en los que se cuantifique la carga proviral mediante la qPCR CV.

En relación a la evaluación de la respuesta del hospedador, el principal avance en esta tesis fue la validación de los métodos para la cuantificación relativa de transcriptos de las citoquinas INFG y TNFA, además del transcripto de origen viral para la proteína regulatoria Tax.

Uno de los grandes desafíos en este punto fue optimizar un método para extraer RNA de calidad para ser cuantificado de manera relativa por qPCR.

El ensayo de inoculación con BLV en animales con genética BoLA DRB3 definida constituye la primer reproducción experimental de los perfiles de infección de BCP y ACP previamente descriptos. El perfil de ACP desarrollado por la totalidad de los animales portadores del alelo *1501, y la alta proporción (6/7) de animales portadores del alelo *0902 que desarrollaron BCP, (en ambos casos siendo los alelos provenientes de distintos padres) confirman la asociación previamente descripta entre estos alelos del gen BoLA DRB3 y la carga viral (Juliarena et al., 2008). La aplicación de las técnicas desarrolladas en esta tesis, y de otras técnicas ya disponibles en el laboratorio, nos permitieron describir por primera vez la cinética de la infección con BLV en estos animales. Ambos grupos de animales replican y expresan el virus en niveles similares hasta los 30 dpi. A partir de los 38 - 45 dpi, momento en el cual ocurre la seroconversión, se comienzan a evidenciar importantes diferencias en la cinética de la carga proviral. Los animales portadores del alelo BoLA DRB3*0902 pudieron controlar al virus, manteniendo un descenso sostenido de la carga viral a partir de los 38 dpi. Por el contrario, en los animales que progresan hacia el perfil de ACP, el provirus continúa su expansión en sangre periférica, a pesar de mantener una respuesta inmune humoral con altos títulos de anticuerpos.

Inicialmente, un animal naturalmente infectado con provirus indetectable en 3 muestras de sangre periférica tomadas con intervalos de 6 meses era considerado con perfil de BCP (Juliarena et al., 2007). En el experimento de inoculación en terneros observamos que el BLV es indetectable por qPCR a partir de los 90 dpi en los animales que progresan al perfil de BCP. Por lo tanto, proponemos que se podría acortar el procedimiento inicialmente utilizado para clasificar los animales según el nivel de carga proviral. Es posible que en condiciones naturales otras variables no contempladas en nuestro experimento influyan en la cinética de la carga proviral.

Nuestra hipótesis de trabajo establecía que los animales resistentes modulaban la expresión viral, generando una respuesta inmune capaz de controlar la expansión del provirus. Los resultados de esta tesis no muestran diferencias significativas en el nivel de expresión de p24 entre los 2 grupos de animales, sin embargo se observan diferencias en el nivel de la respuesta de anticuerpos contra la gp51. Además, el control de la carga proviral comienza a establecerse en el mismo momento que se expresa la respuesta inmune adaptativa. Por lo tanto se concluye que el desarrollo de baja carga proviral es consecuencia de la respuesta inmune adaptativa. Resta por estudiar si existen diferencias en la expresión de otros productos y/o transcriptos virales, que puedan ser responsables de estas diferencias, como así también la expresión de genes del hospedador, principalmente los referentes a la respuesta inmune innata y la respuesta específica

celular. Para este estudio contamos con muestras aptas para el análisis de proteínas y de RNA obtenidas de los animales experimentales.

Referencias

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