Determinación de glutation reducido (GSH) y oxidado (GSSG) Fundamento
Para la determinación de la cantidad de glutation presente en las muestras se empleó el método de Hissin y Hilf (1976), adaptado para placa de 96 pocillos, empleando como sonda fluorescente el O-ftaldialdehido (OPT). Este método se basa en la capacidad del GSH para reaccionar con el OPT a un pH óptimo de 8, dando lugar a la formación de un compuesto fluorescente que se activa a una λ de 350nm y que presenta un punto máximo de emisión a una λ de 420nm. Por otro lado, la forma oxidada del glutation reacciona de forma óptima con la sonda fluorescente a un pH 12. Puesto que a pH >8 el GSH se transforma en GSSG, es necesario bloquear la forma reducida del glutation con N- etilmaleimida (NEM) para determinar únicamente el GSSG presente en la muestra biológica y no el resultante de la oxidación del glutation en presencia de un medio básico.
Técnica:
Se homogeneizó el tejido objeto de análisis con tampón fosfato-EDTA (pH =8) (0,1 M fosfato sódico y 0,005 M EDTA), a una concentración de a 100 mg/Ll, adicionando 10 μL de HClO4(60%) por cada mL de homogeneizado, para desproteinizar. A continuación
se cetrifugó 10 min a 10.000 rpm (4°C) y se recogieron los sobrenadantes. Dichos sobrenadantes se mantuvieron en frío hasta el momento de su utilización para la medida del glutation en sus formas, reducida y oxidada.
Determinación del glutation reducido (GSH):
En una placa de 96 pocillos, se añadió 10 μL de muestra en cada pocillo y se completó con tampón fosfato-EDTA hasta un volumen final de 200 μL. A continuación se añadió 20 μL de OPT diluido en metanol (1 mg/mL), para que reaccionara con el GSH
presente en la muestra. Se mezcló y se incubó en oscuridad a temperatura ambiente
Determinación del glutation oxidado (GSSG):
A 500 μL del sobrenadante de cada muestra se adicionaron 200 μL de NEM (0,04 M), para bloquear el GSH. La muestra se incubó 30 min a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 4,3 mL de NaOH (0,1 N). Se traspasaron 100 μL de la mezcla anterior (corresponden a 10 μL de muestra) al pocillo y se completó con NaOH 0,1 N hasta un volumen final de 200 μL. Se añadieron 20 μL de OPT (1 mg/mL), para que reaccionaran
con el GSSG presente en la muestra. Se mezcló y se incubó en oscuridad a temperatura
ambiente durante 15 min. Finalmente, se midió la fluorescencia a una λexc= 350 nm y λem
= 420 nm.
Dado que la medida de fluorescencia es proporcional a la concentración de GSH y GSSG de cada una de las muestras., se llevó a cabo una curva patrón de concentraciones conocidas de GSH y GSSG, respecto a la fluorescencia emitida (λexc= 350 nm, λem= 420
nm). Los niveles de GSH y de GSSG de cada una de las muestras problema se calcularon interpolando los valores de fluorescencia obtenidos para cada una de ellas en la correspondiente ecuación de la recta. Los resultados se expresan como ng (µg) de GSH o GSSG/mg tejido.
4.4.5.2.2 Índice redox
El índice redox (IR) es un parámetro que ha sido utilizado como índice del estado redox de la célula (Martínez-Cayuela, 2010). Este índice se expresa como el cociente entre la cantidad de glutation reducido respecto al total. Los valores de IR próximos a 1 indicaran una protección celular adecuada frente al estrés oxidativo.
IR = GSH / (GSH+GSSG)
Respecto al glutation oxidado: Se calcula como el cociente entre la cantidad de glutation oxidado (GSSG) respecto al total (GSH+GSSG). Se considera que un organismo será más susceptible al estrés oxidativo según este índice se aproxime más al valor de la unidad.
4.4.5.2.3. Determinación de malondialdehido / sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico
Fundamento:
Los niveles de peroxidación lipídica por reacción con el ácido tiobarbitúrico (TBA) fueron determinados por el método de (Uchiyama y Mihara, 1978). Esta técnica se basa en la capacidad del TBA para reaccionar con una serie de compuestos reactivos al mismo conocidos como TBARS, entre los que se encuentran el MDA, principal producto final de la lipoperoxidación de las membranas de las células. Este complejo TBA-MDA da lugar a la formación de un compuesto coloreado, que absorbe a una λ de 535nm.
Técnica:
Se homogenizan 50mg de tejido en tampón fosfato 50mM, seguido de un proceso de sonicacion por 10 seg con repeticiones de 3 veces a intervalos de 20 seg entre ellas. Se centrifugan los homogeneizados durante 20min a 5100 rpm a 4°C. Del sobrenadante se toma una alicuota de 140µL a la que se adicionan, 1000µL de ácido fosfórico al 1% (con la finalidad de desproteinizar la muestra), 33µL de BHT 0,01% (el cual actúa como antioxidante y se añade a la mezcla de reacción para evitar que se produzcan peroxidaciones adicionales de la muestra durante la fase de calentamiento), y 300µL de TBA al 0,6%, para formar al unirse al MDA un cromóforo. Los tubos donde tienen lugar las reacciones se introducen en un baño María a 100 °C, durante 45 min con agitación constante. Al concluir el tiempo de incubación, se detiene la reacción mediante frío, introduciendo los tubos en hielo. Se le añaden a cada tubo 1400µL de alcohol n-butílico, y se agitan vigorosamente en vortex para extraer las sustancias reactivas al TBA. Posteriormente se centrifugan a 5100 rpm durante 15min a 4°C. Se recolecta la fase orgánica, la cual contiene el complejo TBA-MDA, y se mide la absorbancia en espectrofotómetro a una longitud de onda de 535 nm.
La medida de la densidad óptica es proporcional a la concentración de TBARS de cada una de las muestras. Se realizó previamente una curva patrón con concentraciones de MDA conocidas. Los resultados se expresan en moles de MDA/g de tejido.
4.4.6. EXPRESIÓN GÉNICA DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES Y NO ANTIOXIDANTES.