Statistical m e thods

De todos los grupos se seleccionaron animales al azar para la toma de muestras. Los muestreos se realizaron con peces alimentados el día anterior (para permitir el llenado del intestino y poder recoger muestras de heces). Los peces se extraían del agua sin anestesiar, se depositaban sobre una mesa cubriéndoles los ojos, se retiró el mucus con un portaobjetos (por raspado ligero de la superficie corporal del animal) y una jeringuilla, depositándolo en un tubo de cristal con tapón y refrigerándolo en una bandeja con hielo. Tras la recogida del mucus se anestesiaron (MS-222, 45 mg/l) durante 3 minutos, se midió el índice de madurez gonadal externa de las hembras (índice de madurez gonadal visual

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descrito por Anguis y Cañavate (2005)) y se tomaron muestras de orina recogidas con jeringuilla presionando ligeramente el abdomen y las heces mediante una cánula acompañado por una segunda presión abdominal y una ligera succión, conservando todas las muestras obtenidas en hielo. Se tomaron además muestras de agua del tanque. Antes de depositar los peces en el tanque original, se tomaron los datos del chip de identificación de cada uno de los individuos, para una posterior identificación de las muestras.

MUESTRAS MUESTRAS DE ORINA Y HECES DE LOS ANIMALES

Origen de los individuos a _muestrear muestras _{de orina} muestras _{de heces} replicas stock salvajes

(Santander) Macho sexualmente maduro 1* 1 2 Hembra sexualmente madura 1* 1 2 stock G2 (Santander) macho con madurez _desconocida 1* 1 2 Hembra con madurez _desconocida 1* 1 2 Stock G1 (IRTA)

Tanque 1

Macho sexualmente maduro 1* 1 2 Hembra sexualmente madura 1* 1 2 Stock G1 (IRTA)

Tanque 2

Macho sexualmente maduro 1* 1 2 Hembra sexualmente madura 1* 1 2 Stock inmaduros

(IRTA) Macho sexualmente Inmaduros 1* 1 2 Hembra sexualmente inmadura 1* 1 2 muestras totales

obtenidas 20* 20 40 Figura 5-2 muestras de orina y heces recolectadas . * de las muestras de orina se obtuvieron 4 muestras, por un lado 3 muestras filtradas (eluído de C18, eluído de C2 y filtrado de C2) posteriormente, la orina total, y el eluído de C18 fueron fraccionados y disueltos a 1/1000, 1/10000, 1/100000 y 1/1000000, de igual forma fueron diluidas las heces.

Se centrifugaron las muestras de mucus para eliminar el sobrenadante antes de congelarlas con el resto de muestras a -21ºC hasta su procesamiento y medición mediante el electroolfatograma (EOG).

Muestra de agua:

Se tomaron muestras de los tanques de mantenimiento de los animales, a la salida del tanque y a la entrada del tanque. Estas, presentan un procesado particular: una vez recogidas (1 l por muestra) se concentran primero haciendo

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pasar el agua a través de un cartucho sep-pack (Waters) que fracciona la muestra en función del peso molecular [C-18: 18 carbonos, C-2: 2 carbonos]. Luego a través de silicona consolidada con hidrofobicidad fuerte, utilizada para soluciones acuosas a fin de fijar los analitos por adsorción (incluso los que presentan hidrofobicidad débil) y presenta un comportamiento similar a la CLAR inversa (Waters, WAT023501) que retiene esteroides y lipófilos polares. El resto del agua es descartada. Tras la extracción, se recuperan los productos retenidos mediante la aplicación de 5 ml de metanol, el extracto se guarda en

tubos vidrio congelados a -20º, al igual que el resto de muestras, hasta su utilización.

MUESTRAS MUESTRA DE AGUA DEL TANQUE DE

MANTENIMIENTO MUESTRAS DE AGUA Y MUCO DE LOS ANIMALES muestra de agua control. Entrada Muestra de agua control. Salida Origen de los individuos a muestrear numero de muestras de agua obtenidas muestras de Muco replicas stock salvajes

(Santander) 1 1 Macho maduro 1 1 2 Hembra madura 1 1 2 stock G2 (Santander) 1 1 Macho con madurez desconocida 1 1 2 Hembra con madurez

desconocida 1 1 2 Stock G1 (IRTA) Tanque 1 1 1 Macho maduro 1 1 2 Hembra madura 1 1 2 Stock G1 (IRTA) Tanque 2 1 1 Macho maduro 1 1 2 Hembra madura 1 1 2 Stock inmaduros

(IRTA) 1 1 Macho Inmaduros 1 1 2 Hembra inmadura 1 1 2 muestras

totales

obtenidas 5 5 20 20 50 Figura 5-3 muestras de agua y mucus recolectadas

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Muestras de animales inducidos hormonalmente: Cuatro hembras estabuladas

en el IRTA, con un desarrollo gonadal de 2-3, se usaron para hacer una inducción hormonal, dos de ellas fueron inducidas con PGF2α (Prostaglandina

F2α) (Sigma-Aldrich Chemical Co, Spain)y las otras dos con 17α,20β-dihidroxi- 4-pregnen-3-ona (17,20P) (Sigma-Aldrich Chemical Co, Spain), recogiendo los productos de excreción en el agua desde 80 min. antes de la inducción hormonal hasta 640 min. tras la inducción (Figura 5-4).

Figura 5-5 muestras recolectadas para la secuenciación de animales inducidos 5.2.2 Electro Olfatograma (EOG):

A fin de efectuar el electroolfatograma (EOG) las muestras anteriormente descritas siguen el proceso siguiente:

• Evaporación del metanol

• Dilución en agua control (dilución 1-1 sustituyendo el metanol tras su

evaporación)

• Resuspensión de la muestra que habitualmente esta concentrada en el

fondo.

-80 -40 -20 -10 0 10 20 40 80 160 320 640

Figura 5-4 Secuenciación de productos excretados tras la inducción. Tiempos de toma de muestra

ORIGEN TRATAMIENTO CADA ANIMAL

G1 ( hembra madura IRTA)

1 animal PGF2

α

(Inducción) (1 control de agua + 11 muestras / animal) G1 ( hembra madura IRTA)

1 animal PGF2

α (inducción) 11 muestras / animal G1 ( hembra madura IRTA)

1 animal control (1 control de agua + 11 muestras / animal) G1 ( hembra madura IRTA)

1 animal 17

α ,20β-P (inducción)

11 muestras / animal G1 ( hembra madura IRTA)

1 animal 17

α ,20β-P

(inducción) (1 control de agua + 11 muestras X animal) G1 ( hembra madura IRTA)

1 animal control 11 muestras / animal

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Metodología de grabación del EOG. (Hubbard et al., 2002)

Preparación de los individuos para su medición mediante el EOG

Los animales utilizados en el estudio, son 15 lenguados de pequeño tamaño, y 1 año de edad, con un peso medio de 82,43 ± 17,91 g, aportados por el CCMAR, en Gambelas (Portugal). Cada animal fue trasladado desde los tanques de mantenimiento, en 5 l de agua con 1 g de

MS222 (ácido 3-aminobenzoico éster etílico. Sigma-Aldrich Chemical Co.), donde permanecía durante media hora. Tras esta primera sedación, el animal fue inyectado con 0,2 ml de trietyoduro de galamina (3 mg/kg/1 ml solución salina 0,9%), bloqueante muscular que impide las contracciones musculares involuntarias. El animal era situado en el soporte del Electro- olfatograma donde era rápidamente

intubado para evitar la muerte por falta de oxigeno. El agua para la respiración eran 10 l de agua marina previamente filtrada, con 1 g de MS222, (la mitad de la concentración inicial) para de este modo evitar que el pez despertara en medio del experimento.

Figura 5-7 Soporte y logística del EOG

Figura 5-8 Lamelas olfativas tras retirar el epitelio de la narina

Figura 5-6 Diagrama del fraccionamiento de las muestras de orina. Filtración por peso molecular. Adaptado de Huertas et al, 2007.

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Posteriormente, con un bisturí y en una lupa, se le retiraba el epitelio superficial de la narina, dejando expuesto el epitelio olfativo donde se situaban los electrodos de medición, así como el tubo inyector de muestra.

Se utilizaron aproximadamente 100 muestras por cada animal agrupándolas por muestreo para facilitar la coherencia de los resultados obtenidos. los resultados se registraron con el programa AxoScope y posteriormente en Excel donde fueron tratados para su posterior análisis estadístico.