Step1—Regression analyses in the comparison groups

bacteriana pueda vivir, desarrollarse y reprodu­ cirse son muy complejas. Esto se entiende, si se tiene en cuenta la gran variedad de materiales que la célula utiliza como nutrientes y la gran cantidad de sustancias que se forman como constituyentes celulares, para ello, se requieren energía y condiciones ambientales adecuadas. Antes de que una célula bacteriana realice el proceso de bipartición o división, deben ocurrir muchas reacciones químicas en esa célula. Estas reacciones se conocen con el nombre de metabo­ lismo. Las reacciones metabólicas pueden liberar energía y se denominan reacciones catabólicas o pueden consumir energía y se llaman reacciones anabólicas.

A raíz del concepto anterior, se origina obliga­ toriamente la pregunta: ¿cómo se realizan todas estas actividades celulares?

La respuesta recae en la acción de las enzi­ mas, productos celulares presentes en la célula en cantidades muy bajas y capaces de efectuar todos los cambios propios de los procesos celu­ lares que se asocian al fenómeno de la vida. En cierta forma, las enzimas, pueden considerarse la parte activa de la célula. Cualquier impedimento de la actividad enzimática se refleja en algún cambio en la célula, hasta el punto que podría ocasionarle la muerte.

Existen miles de enzimas diferentes en cual­ quier célula. Las enzimas y sus actividades en la célula viva deben coordinarse de tal forma que proporcionen los productos adecuados a cada lu­ gar, en las cantidades y momentos que convenga y con el mínimo gasto energético. Así que para entender los fenómenos asociados al proceso

de vida, se requiere estar familiarizado con la naturaleza de las enzimas y las reacciones en las cuales intervienen. Por tanto, no puede conside­ rarse la vida sin la presencia de enzimas.

Enzimas

La palabra enzima la propuso Kühne, en 1878, a partir de una palabra griega que significa “en le­ vadura Anteriormente las enzimas se conocían como “fermentos”, porque su acción era similar a la acción de las levaduras.

Para la comprensión de este tema resulta necesario desarrollar el concepto de energía de activación, es decir, el aporte inicial de energía necesaria para poner en marcha una reacción química, algo así como el empujón que necesita una roca que está en la cima de una colina para que empiece a rodar por la pendiente. Este con­ cepto, automáticamente lleva a otro: catálisis. Un catalizador es una sustancia que disminuye la energía de activación de una reacción y, por tanto, aumenta la velocidad de la reacción. Las enzimas son catalizadores biológicos.

Los catalizadores, incluso en pequeñas can­ tidades, tienen especial capacidad de modificar la velocidad de las reacciones químicas, sin ser consumidas ni alteradas como consecuencia de las mismas. Es muy importante tener en cuenta que los catalizadores no intervienen en la ener­ gía o en el equilibrio de una reacción, porque únicamente afectan la velocidad a la cual ocurre la reacción.

Los catalizadores de las reacciones biológi­ cas o agentes catalíticos orgánicos son proteí­ nas conocidas como enzimas. Las enzimas son

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específicas, lo cual significa que solo actúan en un único tipo de reacción química, aunque algunas enzimas pueden hacerlo en cierta cla­ se de reacciones muy afines o estrechamente relacionadas.

Las enzimas corresponden a dos clases o grupos generales:

1. Proteínas simples. Solo contienen residuos de aminoácidos, ejemplo, enzimas digestivas como la tripsina, quimiotripsina y elastasa.

2. Proteínas complejas. Contienen residuos de aminoácidos y un cofactor no aminoácido.

Aunque la síntesis de toda enzima tiene lugar en el interior de la célula, algunas se excretan a través de la pared celular y pueden funcionar fuera de la misma. Por esto, se consideran dos tipos de enzimas:

1. Enzimas extraeelulares, exocelulares o exoenzimas. Funcionan o tienen su acción cata­ lítica fuera de la célula.

2. Enzimas intracelulares, endocelulares o endoenzimas. Cuya acción catalítica se limita al interior de la célula.

La función principal de las enzimas extra- celulares consiste en efectuar cambios precisos en los nutrientes del ambiente externo, para que dichos nutrientes puedan ser transportados al interior de la célula. Por ejemplo, las amilasas son enzimas hidrolíticas que rompen el almidón en moléculas más pequeñas de azúcar para que, en esta presentación, logren pasar al interior de la célula.

Las enzimas intracelulares sintetizan el ma­ terial celular y también degradan los nutrientes, que penetraron en la célula gracias a la acción de las enzimas extracelulares, para proporcionarle sus requerimientos energéticos. Por ejemplo, las hexoquinasas o hexocinasas son enzimas que catalizan la fosforilación de la glucosa y otras hexosas (azúcares elementales) en el interior de la célula. Las características generales de las enzimas son las mismas, independientemente de que sean producidas por células microbianas, humanas o de otros seres vivos. Por ejemplo, muchas de las reacciones enzimáticas que tienen lugar en las levaduras, son idénticas a las de las células musculares humanas.

Propiedades fisicoquímicas

Las enzimas son proteínas, es decir, polímeros de aminoácidos, que pueden o no tener unidos otros grupos químicos y tienen una forma tridi­ mensional específica, por tanto, poseen las mismas propiedades características de las proteínas: 1) se desnaturalizan con el calor; 2) se precipitan con el etanol o con concentraciones elevadas de sales inorgánicas como el sulfato de amonio, y 3) no dializan o difunden, a través de membranas se­ mipermeables o selectivas, porque son moléculas muy grandes.

Algunos autores mencionan en sus artículos ciertos descubrimientos recientes en los cuales se afirma que “las enzimas no son solo proteínas porque algunas moléculas de ARN tienen acti­ vidad catalítica”. Durante muchas décadas, uno de los principios más importantes de la biología molecular afirmaba que la información genética era siempre unidireccional de ADN a ARN y de este a proteína. Howaerd Temin, en 1964, por medio de sus estudios con virus tumorales (oncógenos) que contenían ARN como único material genético, descubrió una importantísi­ ma excepción a esta regla. Muestra de este tipo de enzimas fue descubierta en 1970, por Temin y Baltimore y se conoce con el nombre de transcriptasa inversa o inversotranscriptasa; estos investigadores recibieron en 1975 el Premio Nobel.

Muchas enzimas son una proteína conoci­ da como apoenzima, la cual se combina con una molécula de bajo peso molecular llamada cofactor. Al unirse las dos formas (apoenzima y cofactor) forman una enzima activa llamada holoenzima. El cofactor puede ser orgánico, generalmente derivado de una vitamina, NAD+, FAD+, coenzima A, etc., y se denomina coen­ zima o también, puede ser inorgánico como cualquiera de estos elementos: Mg", Co, Ca, Cu, Fe2+, Zn2+ y Mn, entre otros y se designa grupo prostético.

El esquema de la figura 3.1 proporciona una visión muy clara de la unión de la apoenzima con el cofactor, tanto orgánico como inorgánico, para formar la holoenzima.

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Las dos características más sobresalientes de las enzimas son:

1. Su alto poder catalítico

2. Su alto grado de especificidad por los sustratos.

Una enzima determinada solo puede reac­ cionar con un determinado sustrato, o si acaso, a veces con un grupo de sustratos muy relacionados químicamente; es decir, casi todas son capaces de catalizar una sola reacción o en algunos casos solo unas pocas reacciones químicas estrechamente relacionadas. Esto significa que las células pro­ ducen una enzima para cada una de las moléculas que metabolizan. La especificidad de la enzima se debe a su estructura tridimensional.

Existen también sistemas enzimáticos, por ejemplo, la levadura transforma la glucosa en al­ cohol y dióxido de carbono. Esta transformación no se lleva a cabo por una sola enzima, sino por un grupo de enzimas llamado sistema enzimático (véase figura 3.2).

La enzima amilasa desdobla solo el almi­ dón y no actúa sobre la lactosa o la maltosa y la enzima ureasa, que descompone la urea en amoniaco y dióxido de carbono, no actúa sobre ningún otro sustrato.

Las bacterias pueden crecer en ambientes expuestos a continuos cambios como pH ácido o alcalino. Esto hace que su contenido enzimático característico cambie, en respuesta a las condi­ ciones ambientales, pero solamente dentro de ciertos límites.

En lo que respecta a la influencia del sustrato específico erí la formación de enzimas, las enzi­ mas bacterianas se dividen en dos grupos:

1. Enzimas constitutivas. Siempre son produ­ cidas por las células, independientemente de la constitución del medio en el que se desarrollan.

2. Enzimas adaptativas (inducibles o induci­ das). Son producidas por las células solamente en respuesta a la presencia de un sustrato en particular, esencialmente, solo se producen cuan-

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do se necesitan. El proceso se llama inducción enzimática y el sustrato responsable de inducir la formación de la enzima se denomina inductor.

Condiciones que afectan la actividad enzimática

Entre las condiciones que afectan la actividad enzimática se encuentran:

1. Concentración de la enzima. Si la concen­ tración de la enzima se mantiene constante, la velocidad inicial de una reacción enzimática es directamente proporcional a la concentración del sustrato presente. En este caso la concentración del sustrato es el factor limitante de la velocidad de reacción. Sin embargo, aunque se aumente la concentración del sustrato la velocidad de reacción no aumentará porque las moléculas de enzima se saturarán de él.

2. Concentración del sustrato. En este caso la concentración de la enzima es el factor limitante de la velocidad de la reacción. De esta forma, la velocidad inicial de la reacción es directamente proporcional a la concentración de enzima presente.

3. pH. La mayoría de las enzimas requieren un pH óptimo para mantenerse activas y solo lo consiguen en un rango muy reducido: entre 6 y 8. Las variaciones de pH modifican las cargas de la enzima produciendo un cambio en su actividad.

Si el medio se toma muy ácido o muy básico, muchas enzimas se inactivan y generalmente se desnaturalizan de manera irreversible. Algunas bacterias son excepciones a esta norma y pueden crecer a pH muy ácido, como los lactobacilos.

4. Temperatura. Muchas enzimas necesitan una temperatura óptima para que la reacción al­ cance la máxima velocidad. Las temperaturas altas inactivan rápidamente a la mayoría de las enzimas produciéndoles una alteración molecular de tipo irreversible, por tanto, no se reactivan cuando se enfrían. Gran cantidad de organismos encuentra la muerte cuando son expuestos brevemente a altas temperaturas, que ocasionan inactivación de sus enzimas y no pueden continuar su metabolismo.

Existen algunas especies bacterianas que son excepciones a esta regla porque pueden crecer y desarrollarse a temperaturas muy altas, como las que viven en aguas de manantiales calientes, con temperaturas superiores a los 100 °C (por ejemplo, en los géiseres de agua caliente del Yellowstone Park en Estados Unidos), otras logran sobrevivir a temperaturas superiores a las de ebullición y altas presiones atmosféricas en manantiales calientes submarinos.

Temperaturas extremadamente bajas detie­ nen la actividad enzimática, pero no destruye las enzimas. De esta forma pueden conservarse man­ teniéndolas a temperaturas de 0 °C o menos.

Reacciones fundamentales

Las bacterias poseen cientos o millares de en­ zimas, pero las reacciones fundamentales son:

1. Reducción. Incorporación de hidrógenos o electrones (e-).

2. Oxidación. Separación de hidrógenos o electrones (e~).

3. Deshidratación. Pérdida de una molécula de agua del sustrato.

4. Hidrólisis. Introducción de agua en un enlace específico del sustrato.

5. Desanimación. Separación de un grupo amino (NH2).

6. Descarboxilación. Separación de C 0 2 de un grupo carboxilo (COOH).

7. Fosforilación. Adición de un grupo fosfato a una molécula orgánica.

Nomenclatura

Los nombres aplicados a las enzimas se han ajustado al criterio individual de los investiga­ dores. En muchos casos a una misma enzima se le conoce con diferentes nombres o se les da el mismo nombre a enzimas diferentes.

También muchos de estos nombres de las enzimas no dan idea, o dan muy poca, de la na­ turaleza de las reacciones que catalizan. Debido a esta situación la nomenclatura enzimática se tomó caótica (véase tabla 3.1).

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Tabla 3.1 Función de las principales clases de enzimas Clase Reacción catalítica

Oxido-reductasas Reacciones de transferencia de electrones o átomos de hidrógeno. Catalizan reaccio­ nes de óxido-reducción

Transferasas Transferencia de grupos funcionales (entre los grupos funcionales se incluyen fosfa­ to, amino, metilo, etc.). Catalizan la transferencia de un grupo funcional de una molé­ cula donadora a una receptora

Hidrolasas Catalizan reacciones de hidrólisis, es decir, adicionan una molécula de agua para romper enlaces químicos

Liasas Catalizan reacciones en las cuales se forman o se rompen enlaces dobles. Adición a dobles enlaces de moléculas, así como eliminación hidrolítica de grupos químicos

Isomerasas Catalizan reacciones de isomerización, es decir, reacciones en las que un compuesto se transforma en un isómero (imagen en espejo), este compuesto resultante tiene los mismos átomos, pero con diferente estructura molecular

Ligasas Formación de enlaces con hidrólisis de ATP (adenosina trifosfato), o sea, que catali­ zan reacciones en las cuales se unen dos moléculas

Reglas para nombrar y clasificar las enzimas

Naturaleza y mecanismo de la acción enzimática

Cuando el nombre de las enzimas termina en asa, debe usarse para una sola enzima, por ejemplo, enzima catalasa, que cataliza el peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua. Cuando se desea nombrar un conjunto de enzimas que catalizan un conjunto de reacciones, se debe usar la pala­ bra sistema', por ejemplo, el sistema succinato- oxidasa, que cataliza la oxidación del succinato por 0 2 y lo forman succinato-deshidrogenasa, citocromo-oxidasa y varios acarreadores inter­ medios.

Para la clasificación solo se consideran enzi­ mas individuales y no sistemas enzimáticos. El desarrollo reciente de la enzimología ha creado un problema nuevo respecto a la nomenclatura de las enzimas, porque se ha encontrado que muchas tienen formas estructurales diferentes, pero propiedades catalíticas idénticas o casi idénticas. A estas enzimas se les da el nombre de isoenzimas o isozimas.

La mayor parte de las reacciones enzimáticas pueden representarse por una ecuación general (véase figura 3.3).

La enzima E y el sustrato S se combinan para formar un complejo enzima sustrato ES que des­ pués se rompe para dar el producto P. La enzima no se consume en la reacción, sino que se libera para reaccionar de nuevo con otra molécula de sustrato. Este proceso se repite muchas veces hasta que se agotan las moléculas de sustrato.

El concepto activación de sustrato, subsiguien­ te a la formación del complejo enzima-sustrato es básico en la teoría sobre el mecanismo de acción enzimática. La activación permite la modificación del sustrato por causa de la acción enzimática. La activación de la molécula de sustrato se produce gracias a su elevada afinidad química por determinadas áreas de la superficie de la enzima conocidas con el nombre de sitio activo o sitio catalítico. Estos sitios se presentan como una especie de bolsa, donde se encuen­ tran cadenas de aminoácidos que forman, en la enzima, una superficie tridimensional que se complementa con el sustrato. Entonces, cuando se acoplan el sustrato y la enzima por su sitio ac­ tivo, se produce una distorsión o tensión en algún

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enlace de la molécula de sustrato, de tal manera que se hace lábil o inestable y sufre un cambio determinado por la enzima en cuestión.

Las moléculas modificadas carecen de afini­ dad por los sitios activos, por tanto, después de ocurrida la reacción, las moléculas son liberadas. La enzima queda libre para combinarse con nuevas moléculas de sustrato y repetir la acción (véase figura 3.4).

Inhibición de la acción enzimática

La actividad de una enzima puede inhibirse por ciertos agentes químicos y de diversas formas. Al­ gunos inhibidores se unen a la enzima en el mismo sitio que el sustrato (sitio catalítico o sitio activo); otros lo hacen en alguna región alejada de este, llamada sitio alostéñco. Este sitio es donde las moléculas reguladoras, conocidas como efectores

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alostéricos, se unen a la enzima con el fin de alte­ rar su conformación y su actividad. Una enzima puede presentar más de un sitio alostérico.

La inhibición de las enzimas se clasifica en dos tipos: reversible e irreversible.

1. Inhibición reversible. Un inhibidor forma enlaces químicos débiles con la enzima y puede ser competitiva o no.

2. Inhibición irreversible. Hay por lo general destrucción de uno a más grupos funcionales de la enzima.

Inhibición reversible

Existen dos tipos muy importantes de inhibición reversible, denominados inhibición competitiva e inhibición no competitiva, los cuales se diferen­ cian porque la inhibición competitiva se puede revertir mediante el incremento de la concentra­ ción del sustrato, en tanto que la inhibición no competitiva, no puede hacerlo.

1. Inhibición competitiva. Un inhibidor competitivo (metabolito o fármaco) con estruc­ tura química similar a la del sustrato forma un complejo con la enzima e impide la unión del sustrato en el sitio activo; es decir, compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima. El inhibidor competitivo ocupa el sitio activo solo por un tiempo y no causa daños permanentes en la enzima. Esta inhibición puede anularse por el incremento de la concentración del sustrato, de manera que las moléculas de sustrato excedan en número a las del inhibidor.

En la figura 3.5 se observa un esquema re­ presentativo de la inhibición competitiva, entre el ácido malónico y el ácido succínico.

2. Inhibición no competitiva. Este tipo de inhibición se produce cuando se encuentran una enzima con dos sitios de unión importantes: el sitio activo, propiamente dicho, y otro conocido como sitio alostérico, la enzima con estas ca­ racterísticas se conoce como enzima alostérica. El inhibidor se une con la enzima en el sitio alostérico, esto lo lleva a inactivarse porque se modifica su forma, de modo que el sustrato no puede unirse al sitio activo y, por tanto, no se produce el proceso catalítico. El inhibidor y el

sustrato pueden unirse simultáneamente y la pre­ sencia del inhibidor afecta el proceso catalítico, de tal manera que puede inactivarlo o hacer que la formación de los productos finales sea dema­ siado lenta (véase figura 3.6).

Inhibición irreversible

La inhibición irreversible la causan agentes lla­ mados inhibidores enzimáticos irreversibles, que generalmente son sustancias tóxicas, naturales o sintéticas que “envenenan” a las enzimas. El inhibidor se combina con algún grupo funcional del sitio activo de la enzima, forma un enlace covalente y la deja, catalíticamente, inactiva o la destruye en forma permanente. Una gran varie­ dad de “venenos” enzimáticos como: los iones de metales pesados (Ag+, Hg2+), agentes oxidantes, la yodo-acetamida, cianuro, penicilina, aspirina, entre otros, que inactivan la enzima en forma permanente o cuando mucho, se reactiva muy lentamente (esto requiere horas o días). Este tipo de inhibidores no tienen semejanza estructural con el sustrato, por tanto, un incremento en la concentración de este resulta ineficaz para su­ primir tal inhibición.

Metabolismo bacteriano

El metabolismo lo constituye el conjunto de re­ acciones químicas que una célula lleva a cabo y que producen o utilizan energía para la síntesis de componentes celulares o para otras actividades de la célula, como el movimiento. El metabolismo