Structure of the Thesis - LIST OF TABLES 4

LIST OF TABLES 4

1.4 Structure of the Thesis

Para su posterior análisis mediante técnicas in vivo, la proteína 3A completa así como sus versiones mutadas, indicadas en la Fig. 13, fueron clonadas como proteínas de fusión con el extremo C-terminal de la proteína verde fluorescente (green fluorescent protein, GFP).

3A ISIPSQKSVLYFLIEKGQHE AAIEFFEGMVHDSIKEELRPLIQQTSFVKR AFKRLKENFEIVALCLTLLA NIVIMIRETH KRQKMVDDAVNEYIEKANITTDDQTLDEAE KNPLETSGASTVGFRERTLPGQKARDDVNSEPAQPTEEQPQAE

3AL38E ISIPSQKSVLYFLIEKGQHE AAIEFFEGMVHDSIKEEERPLIQQTSFVKR AFKRLKENFEIVALCLTLLA NIVIMIRETH KRQKMVDDAVNEYIEKANITTDDQTLDEAE KNPLETSGASTVGFRERTLPGQKARDDVNSEPAQPTEEQPQAE

3AL41E ISIPSQKSVLYFLIEKGQHE AAIEFFEGMVHDSIKEELRPEIQQTSFVKR AFKRLKENFEIVALCLTLLA NIVIMIRETH KRQKMVDDAVNEYIEKANITTDDQTLDEAE KNPLETSGASTVGFRERTLPGQKARDDVNSEPAQPTEEQPQAE

3AC65S ISIPSQKSVLYFLIEKGQHE AAIEFFEGMVHDSIKEELRPLIQQTSFVKR AFKRLKENFEIVALSLTLLA NIVIMIRETH KRQKMVDDAVNEYIEKANITTDDQTLDEAE KNPLETSGASTVGFRERTLPGQKARDDVNSEPAQPTEEQPQAE G1 ISIPSQKSVLYFLIEKGQHEAAIEFFEGMVHDSIKEELRPLIQQTSFVK**************************************************

(ΔK53-E153) *********************************************************************************************************************************

G1t ISIPSQKSVLYFLIEKGQHE AAIEFFEGMVHDSIKEELRPLIQQTSFVKR AFKRLKENFEIVALCLTLLA NIVIMIRETH (Δ R82-E153) KR******************************************************************************************************************************

NTT *****************************************************************LIQQTSFVKR AFKRLKENFEIVALCLTLLA NIVIMIRETH (ΔI1-L41) KRQKMVDDAVNEYIEKANITTDDQTLDEAE KNPLETSGASTVGFRERTLPGQKARDDVNSEPAQPTEEQPQAE

Sus tit uci o n e s Delec c io ne s

wt 3A ISIPSQKSVLYFLIEKGQHE AAIEFFEGMVHDSIKEELRPLIQQTSFVKR AFKRLKENFEIVALCLTLLA NIVIMIRETH KRQKMVDDAVNEYIEKANITTDDQTLDEAE KNPLETSGASTVGFRERTLPGQKARDDVNSEPAQPTEEQPQAE

3AL38E ISIPSQKSVLYFLIEKGQHE AAIEFFEGMVHDSIKEEERPLIQQTSFVKR AFKRLKENFEIVALCLTLLA NIVIMIRETH KRQKMVDDAVNEYIEKANITTDDQTLDEAE KNPLETSGASTVGFRERTLPGQKARDDVNSEPAQPTEEQPQAE

3AL41E ISIPSQKSVLYFLIEKGQHE AAIEFFEGMVHDSIKEELRPEIQQTSFVKR AFKRLKENFEIVALCLTLLA NIVIMIRETH KRQKMVDDAVNEYIEKANITTDDQTLDEAE KNPLETSGASTVGFRERTLPGQKARDDVNSEPAQPTEEQPQAE

(ΔK53-E153) *********************************************************************************************************************************

Sus tit uci o n e s Delec c io ne s wt

Figura 13. Secuencias de la proteína 3A wt y los distintos mutantes clonados en pEGFP-C2. Los residuos deleccionados en cada una de las proteínas se indican entre paréntesis.

Para llevar a cabo estos clonajes se empleó el plásmido pEGFP-C2 (Clontech), descrito en el apartado M4 y mostrado esquemáticamente en la Fig. 14. Este plásmido codifica para una variante de la proteína GFP, la EGFP (enhanced GFP) que ha sido optimizada

Materiales y métodos

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para tener un mayor brillo de fluorescencia y ser expresada en altos niveles en células de mamíferos (Heim y col., 1995). La proteína verde fluorescente proviene de la medusa Aequorea victoria (Shimomura y col., 1962) y su gen fue el primero en ser clonado (Prasher y col., 1992) y expresado en sistemas heterólogos (Chalfie y col., 1994; Inouye y col., 1994) entre las proteínas verdes fluorescentes de diferentes organismos que se conocen.

P CMV Aequorea victoria EGFP

MCS R Kan/Neo 3A 4700bp pEGFP-C2 _BglII HindIII EcoRI BamHI XbaI BclI

Figura 14. Esquema del plásmido pEGFP-C2 donde se representa dentro del MCS (multiple cloning site) las enzimas utilizadas en los clonajes de la proteína 3A y los distintos mutantes. A la derecha se ha incluido una representación de la estructura tridimensional de la EGFP que está constituida por 238 aminoácidos que forman un barril de 11 láminas β rodeando una α-hélice central donde se encuentra el cromóforo que se mantiene enterrado en el centro del cilindro (Ormo y col., 1996; Yang y col., 1996).

Para obtener la construcción pEGFP3Awt se amplificó el cDNA de VFA que contenía la secuencia completa de la proteína 3Awt empleando los oligonucleótidos 3ABamHI / 3A-2. La construcción pEGFPG1 se realizó de manera análoga, empleando los oligonucleótidos 3ABamHI /3A-5. Para las construcciones que contenían además de la 3A las tres copias de la proteína 3B se utilizaron los oligonucleótidos 3ABamHI /3A3BBB. El vector pEGFP fue digerido con BamHI y con BclI que genera extremos compatibles con BglII pero es sensible a dam metilasas por lo que se tuvo que extraer el DNA plasmídico (pEGFP-C2) de una cepa bacteriana que no las produjera, la E.coli JM110.

Materiales y métodos

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El mutante NTT se generó utilizando los oligonucleótidos NTT/3AfHind y las enzimas de restricción utilizadas para digerir los insertos fueron BglII y HindIII. El mutante G1t se generó con la pareja de oligonucleótidos t3AHind/rG1t, los fragmentos amplificados se digirieron con HindIII y BamHI. En ambos casos, el clonaje en el vector se realizó con las mismas enzimas de restricción. Las secuencias de los oligonucleótidos se indican en la Tabla 6.

Para los mutantes 3AL38E, 3AL41E y 3AC65S se partió de los clones correspondientes en el plásmido pM (apartado M10) cuyos insertos específicos, mediante digestión con EcoRI y XbaI, se reclonaron en pEGFP-C2.

Las construcciones obtenidas fueron secuenciadas para confirmar que las proteínas del VFA estuvieran en fase con GFP, para lo que se utilizaron los oligonucleótidos detallados en la Tabla 6.

Tabla 6. Oligonucleótidos utilizados para el clonaje en el vector pEGFP-C2.

Oligonucleótido Secuencia de nucleótidos Orientaciónb

NTT CGGAGATCTGGATCCAACAAACTTCA S rG1t GCCGGATCCTTACTTGTGAGTCTCGC A

f3AHind GCGAAGCTTGATCTCAATACCTTCC S

pEGFPfa_{ATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGA} _S

pEGFPra_{ACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTC} _A

a – Oligonucleótidos utilizados para secuenciar los productos clonados. b- S: “sentido” (orientación genómica). A: “antisentido”.

13. Clonaje del doble mutante 3AL38EL41E en pRSV

Partiendo del plásmido pRSV3AL41E (Fig. 15), se utilizó la técnica de overlap extension (Sambrook y col., 2001) para generar el doble mutante pRSV3AL38EL41E. Para ello se diseñaron dos oligonucleótidos que amplificaban la región de 3A y que incluían la sustitución L38E, cuya secuencia se detalla en la Tabla 7. Se realizaron 3 amplificaciones que se esquematizan en la Fig. 15. Primeramente y utilizando como molde el pRSV3AL41E y un oligonucleótido “sentido” con secuencia wt (3A1) y otro “antisentido” con secuencia mutada (3AL41EL38E-1) (flechas rojas en el esquema), se obtuvo el producto amplificado denominado PCR 1. En una segunda amplificación en la que se empleó el oligonucleótido “sentido” con la secuencia mutada (3AL41EL38E-2) y

Materiales y métodos

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el “antisentido” de secuencia wt (3A2) (flechas azules en el esquema), se obtuvo el producto de amplificación PCR 2. Finalmente, mezclando cantidades equimolares de los productos PCR1 y PCR2 como molde, se realizó una tercera amplificación con los oligonucleótidos wt (3A1/3A2) externos a la región mutada.

HindIII KpnI 4716bp Amp R 3AL41E RSV LTR pRSV-3AL41E _A( n) L38E

3A1 3AL38EL41E 1 _3A2

3AL38EL41E 2 PCR 1

PCR2 PCR3

Figura 15. Esquema del plásmido pRSV3AL41E y de la estrategia de mutagénesis por overlap

extension seguida para obtenerle doble mutante pRSV3AL38EL41E. Se indican las enzimas de

restricción utilizadas en el clonaje, HindIII y KpnI. En el plásmido se representa el gen de resistencia a la ampicilina, en azul claro la señal de poliadenilación A(n) derivada del virus SV40 y el promotor LTR. A la derecha se representan los oligonucleótidos utilizados para las amplificaciones y los productos de PCR en cada reacción.

Tabla 7. Oligonucleótidos utilizados para la introducción de la mutación puntual L38E en la proteína 3AL41E.

Oligonucleótido Secuenciaa_Orientaciónb

3A1 HindIII GCGAAGCTTTCTAGAATGATCTCAATACCTTCC S

3A2 KpnI TATAGTTCTGGTACCTTATTCAGCTTGCGGTTG A

L41EL38E-1 TTGGATCTCGGGCCGCTCTTCCTCCTTA A

L41EL38E-2 TAAGGAGGAAGAGCGGCCCGAGATCCAA S

a- Se indica el triplete mutagenizado subrayado

b- S: “sentido” (orientación genómica). A: “antisentido”.

14. Secuenciación

Los diferentes plásmidos desarrollados a lo largo de ésta Tesis Doctoral fueron secuenciados para confirmar su correcta construcción. Las secuencias fueron

Materiales y métodos

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determinadas en la Unidad de Genómica de Parque Científico de Madrid, utilizando un secuenciador multicapilar ABI Prism 3100, 3700, o 3730 (Applied Biosystems). Para ello se emplearon los cebadores indicados en cada clonaje.

15. Tratamientos bioquímicos para caracterizar interacciones de la proteína 3A

In document Taxing and Pleasing: The Rhetoric and Reality of Vertical Equity in the Development of the New Zealand Income Tax on Employees, 1891 to 1984 (Page 37-41)