En el presente trabajo se han estudiado 4 ejemplares machos de la subespecie
Zelurus
femoralis longispinis
diferenciándose dos citotipos. Dos de los cuatro ejemplares poseen 2n=22=20A+XY (macho) (Figura 61a), mientras que los dos restantes 2n=23=20A+XY+cromosoma extra (macho) (Figura 61b). Durante la prometafase espermatogonial de ambos citotipos se puede observar que los cromosomas del complemento decrecen de tamaño en forma gradual. No se pueden diferenciar los cromosomas sexuales de los autosomas en este estadio (Figura 61a-b). Cabe destacar que todas las células de cada individuo posee un único número diploide; más aún, en aquellos individuos portadores del cromosoma extra, dicho cromosoma está presente en todas las células analizadas, tanto en mitosis espermatogonial como en las células meióticas.Durante la primera división meiótica, en el estadio difuso luego de paquitene, los bivalentes (II) autosómicos se descondensan parcialmente y los univalentes (I) sexuales son heteropicnóticos positivos ubicándose cercanos entre sí (Figura 61c). En los ejemplares que portan el cromosoma extra, éste es el más pequeño, heteropicnótico positivo y se encuentra junto a los dos cromosomas sexuales (Figura 61d). A medida que avanza la profase I, los II se vuelven a condensar, siendo visibles nuevamente en diplotene temprano aunque aún no se pueden diferenciar uno de otro (Figura 61e). En diacinesis temprana se reconocen diez II autosómicos; tanto los cromosomas sexuales como el cromosoma extra continúan cercanos entre sí y se tornan isopicnóticos (Figura 61f-g). En metafase I, los II, los I sexuales y el cromosoma extra adquieren su máxima condensación. En este estadio se distinguen diez II, que pueden presentar uno o dos quiasmas terminales, dos I sexuales y el cromosoma extra, que se disponen separados uno de otro (Figura 61h). En anafase I, los II se dividen reduccionalmente, mientras que los I sexuales y el cromosoma extra se separan de forma ecuacional (Figura 61i). Como consecuencia, los núcleos telofásicos I presentan 12 cromosomas cada uno en los individuos sin cromosoma extra y 13 en aquellos que sí lo poseen (Figura 61j). En metafase II se reconocen 10 autosomas formando un anillo, en cuyo centro se ubican los cromosomas sexuales asociados extremo con extremo y formando un pseudobivalente (Figura 61k). En los dos individuos que portan el cromosoma extra, éste se dispone
CAPITULO VI Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 142 | P á g i n a
en el centro del anillo muy cercano al pseudobivalente sexual en 94,7% de las células analizadas (Figura 61l), mientras que en 5,3% se ubica formando parte del anillo de autosomas (Figura 61m) (38 metafases II analizadas). En anafase II, los autosomas se dividen de manera ecuacional y los cromosomas sexuales y el cromosoma extra lo hacen de forma reduccional. Como resultado de esta división se obtienen dos células hijas con 10A+X, 10A+Y en los individuos que no presentan el cromosoma extra. Dado que no se hallaron células en anafase II y telofase II que permitan determinar la constitución de las células hijas resultantes, se infiere que éstas podrían estar constituidas por: 10A+Y, 10A+X+cromosoma extra; 10A+X, 10A+Y+cromosoma extra.
Medición de la longitud de los cromosomas sexuales en individuos de
Z. femoralis longispinis
con 2n=22 y 2n=23Con el fin de dilucidar el posible origen del polimorfismo para el número diploide en esta especie, se comparó el largo promedio en porcentaje de los cromosomas sexuales en individuos con y sin cromosoma extra (23 y 22 cromosomas respectivamente). La comparación se realizó mediante una prueba T para muestras con números muestrales y varianzas diferentes.
En la Tabla 10 se puede ver que el largo total promedio de los cromosomas sexuales en los individuos con 2n=22 es significativamente mayor a los que poseen 2n=23.
CAPITULO VI Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 143 | P á g i n a
Figura 61: Zelurus femoralis longispinis. a-m. Preparaciones cromosómicas por aplastado, tinción con hematoxilina. a. Prometafase espermatogonial (2n=22), b. Prometafase espermatogonial (2n=23), c. Estadio difuso (2n=22), d. Estadio difuso (2n=23), e. Diplotene temprano (2n=22), f. Diacinesis temprana (2n=23), g. Diacinesis (2n=22), h. Metafase I (2n=23), i. Anafase I (2n=23), j. Telofase I (2n=23), k. Metafase II (2n=22). l- m. Metafase II (2n=23). Flechas: cromosomas sexuales. Punta de flechas: cromosoma extra. Barra 10 µm.
CAPITULO VI Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 144 | P á g i n a
Tabla 10: Zelurus femoralis longispinis. Muestra qué porcentaje del largo total de los cromosomas del complemento está representado, en promedio, por los
cromosomas sexuales en individuos con 2n=22 cromosomas y 2n=23 cromosomas. Se detallan: el valor promedio (X), el desvío estándar (S), el valor
de la prueba T (T), los grados de libertad (GL) y el valor crítico (VC) con un error () de 5%.
Prom (long. Sex/long. total)% 2n=22
Prom (long. Sex/long. total)% 2n=23 12,77 11,59 11,15 12,49 13,9 11,88 13,5 10,4 12,62 10,66 12,5 10,17 12,35 10,89 13,2 12,07 12,78 12,24 12,87 X 12,66 11,15 S 0,71 0,85 T 4,05 GL 11 VC (=0,05) 2,2 Bandas C
En ambos complementos cromosómicos, tanto en la prometafase espermatogonial como en todos los estadios de la meiosis, se observa que uno de los cromosomas sexuales es completamente heterocromático, mientras que el restante posee una banda C positiva en uno de sus extremos. Además, ambos citotipos no presentan bandas C positivas conspicuas en ningún otro cromosoma del complemento (Figura 62). De este modo, el patrón de bandas C permite diferenciar a los dos cromosomas sexuales y determinar la disposición de estos cromosomas y la del cromosoma extra en la placa metafásica: el cromosoma extra se orienta junto al cromosoma sexual que posee una banda terminal en 85,4% de las células en metafase II (Figura 62h) y en una posición indeterminada, i.e. se ubica en el medio de ambos, en un 14,6% (Figura 62i) (41 células analizadas).
CAPITULO VI Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 145 | P á g i n a
Figura 62: Zelurus femoralis longisponis. a-i. Bandas C. a. Prometafase espermatogonial (2n=22), b. Estadio difuso (2n=22), c. Estadio difuso tardío (2n=23), d. Diplotene temprano (2n=22), e. Diacinesis (2n=23), f. Telofase I (2n=23), g. Metafase II (2n=22), h-i. Metafase II (2n=23). Flechas: cromosomas sexuales. Punta
CAPITULO VI Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 146 | P á g i n a
Bandas secuenciales fluorescentes DAPI-CMA3
Uno de los cromosomas sexuales es completamente DAPI positivo-CMA3 negativo (Figura
63). Durante el estadio difuso se observa una banda diminuta CMA3 positiva en este mismo
cromosoma, aunque no es posible distinguirla en el resto de los estadios de la meiosis (Figura 63d). No se revelan bandas conspicuas tanto DAPI como CMA3 en el resto de los cromosomas del
complemento (Figura 63a-h).
FISH con sonda de ADNr 18S
En ambos citotipos, tanto en la prometafase espermatogonial como en todos los estadios de la meiosis, se observan que las señales de hibridación se encuentran en una de las regiones terminales de ambos cromosomas sexuales (Figura 64). Durante prometafase espermatogonial las señales de hibridación están localizadas en ambos cromosomas sexuales, uno de ellos es completamente C positivo (Figura 64a). En el estadio de paquitene, los cromosomas sexuales se encuentran condensados y portan las señales de hibridación; no se reconocen señales de hibridación en la cromatina autosómica (Figura 64b). En diacinesis (Figura 64c-d) y metafase I (Figura 64e), las señales de hibridación se observan en una de las regiones terminales de cada univalente sexual X e Y; el cromosomas extra no presenta señal de hibridación (Figura 64c-e). En metafase II, la sonda de ADNr hibrida en una de las regiones terminales de ambos cromosomas sexuales (Figura 64f).
CAPITULO VI Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 147 | P á g i n a
Figura 63: Zelurus femoralis longispinis. a,c,e,g. Bandas DAPI, b,d,f,h. Bandas CMA3. a-b. Prometafase espermatogonial (2n=22), c-d. Estadio difuso (2n=23), e-f.
Metafase I (2n=22), g-h. Metafase II (2n=22). Flechas: cromosomas sexuales. Punta de flecha: cromosoma extra. Barra: 10 µm.
CAPITULO VI Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 148 | P á g i n a
Figura 64: Zelurus femoralis longispinis. a-f. FISH con sonda de ADNr 18S. a. Prometafase espermatogonial (2n=22), b. Paquitene (2n=22), c. Diacinesis (2n=23), d. Diacinesis (2n=22), e.
Metafase I tardía (2n=23), f. Metafase II (2n=22). Señal de hibridación (rojo), cromosomas contrateñidos con DAPI (azul). Flechas: cromosomas sexuales. Punta de flecha: cromosoma extra.
CAPITULO VI Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 149 | P á g i n a
DISCUSIÓN La población de la subespecie
Zelurus femoralis longispinis
de Pampa del Indio (Chaco, República Argentina) presentó dos cariotipos diferentes: 2n=22A+XY y 2n=22A+XY+cromosoma extra. Debido a que ambos citotipos se observaron en dos de los cuatro individuos analizados y, también, en los dos años de muestreo (2008 y 2011), se podría concluir que esta subespecie presenta un polimorfismo estable para el número cromosómico.En general, teniendo en cuenta las características cariotípicas y el comportamiento meiótico de los ejemplares analizados, se infiere que
Z. femoralis longispinis
(Reduviinae) presenta un número cromosómico y un cariotipo que concuerda con lo previamente descripto (ver CAPITULO II). Desde el punto de vista filogenético, se ha propuesto que Reduviinae tendría un origen polifilético, donde el géneroZelurus
se encuentra formando un grupo junto a Triatominae y Stenopodainae (Weirauch y Munro, 2009). Si consideramos los caracteres citogenéticos, tanto Triatominae como Stenopodainae se caracterizan por poseer un número diploide bajo de autosomas para la familia Reduviidae (números modales que oscilan entre 20 y 22 autosomas) y sistemas simples y múltiples de cromosomas sexuales (CAPITULO II, Figura 29). Si se tiene en cuenta el número de autosomas y el sistema de cromosomas sexuales de la subespecie deZelurus
aquí estudiada, se concluye que la misma comparte las características cariotípicas de las subfamilias más cercanas. Estas evidencias apoyan el lugar propuesto para el género en la filogenia de Reduviidae (Weirauch y Munro, 2009).En cuanto al contenido de heterocromatina, es característico de los redúvidos que el cromosoma Y sea completamente heterocromático (Panzera et al., 1998; Poggio, 2007). En base a estos antecedentes, se propone que el cromosoma sexual completamente C positivo de
Z. femoralis
longispinis
sería el cromosoma Y, mientras que el cromosoma que posee una banda terminal sería el X. Por otra parte, en el presente trabajo se determinó que losclusters
de ADNr se ubican en ambos cromosomas sexuales, tanto en los individuos con 22 cromosomas como en aquellos que poseen 23 y no resultaron ser ricos en pares de bases GC. La misma localización y número de genes ribosomales fue descripta enA. lanipes
(presente trabajo), dos especies del géneroRhodnius
(Morielle-Souza y Azeredo-Oliveira, 2007; Panzera et al., 2012), una de
Psammolestes
y deEratyrus
(Panzera et al., 2012) y cuatro pertenecientes a
Triatoma
(Bardella et al., 2010; Panzera et al., 2012). Sólo en dos de estas especies el ADNr colocalizó con una banda CMA3 positiva y, por lo tanto, laCAPITULO VI Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 150 | P á g i n a
Origen del Cromosoma Extra
En dos de los cuatro individuos analizados se observó la presencia de un cromosoma extra en todas las células analizadas. Este cromosoma se caracteriza por ser de tamaño pequeño, heteropicnótico positivo en la profase I temprana, segregar ecuacionalmente en la primera división meiótica y, en la mayoría de los casos, estar asociado a los cromosomas sexuales y orientado junto al cromosoma sexual X, que posee una banda heterocromática terminal en metafase II.
Con el fin de evaluar el posible origen del cromosoma extra se comparó el largo promedio relativo de los cromosomas sexuales de los individuos con y sin cromosoma extra, determinando que el largo promedio es significativamente mayor en los individuos no portadores del cromosoma extra, respecto a los que sí lo poseen. Además, al comparar el contenido, distribución y composición de heterocromatina y la localización y el número de
clusters
de ADNr, no se detectaron diferencias en ambos citotipos. Teniendo en cuenta que el cromosoma extra está presente en todas las células analizadas de los individuos que lo portan, posee un comportamiento meiótico regular y segrega junto al cromosoma sexual X en anafase II, se puede inferir quea priori
no se trataría de un cromosoma B, sino que sería probablemente un cromosoma sexual originado por fragmentación del cromosoma X original. Más aún, el cromosoma X de los individuos con y sin cromosoma extra posee una banda heterocromática terminal que colocaliza con el ADNr; por consiguiente, el extremo donde habría ocurrido la fragmentación que dio origen al cromosoma extra, sería el contrario a la región C positiva y portadora de la NOR (Figura 65). Por todo lo expuesto, la población de Pampa del Indio deZ. femoralis longispinis
presentaría un polimorfismo estable para el sistema de cromosomas sexuales y, por lo tanto, coexistirían en la población individuos machos con 2n=20A+XY y con 2n=20A+X1X2Y.Figura 65: a. El diagrama ilustra la posible ubicación del sitio de ruptura en el cromosoma sexual X y el posible origen del cromosoma extra en la población de Pampa del Indio (Chaco, Argentina) de Zelurus
CAPITULO VI Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 151 | P á g i n a
Existen algunos ejemplos de polimorfismos en Heteroptera, entre ellos se pueden mencionar los trabajos realizados por Papeschi (1996) y Heizer (1950) quienes describieron polimorfismos para el sistema de cromosomas sexuales en especies de Belostomatidae (Nepomorpha) y Pentatomidae (Pentatomomorpha) respectivamente. En ambos casos los sistemas múltiples habrían surgido a partir de un sistema simple XY/XX por fragmentación del cromosoma X, lo cual fue sustentado no sólo por el comportamiento cromosómico, sino también por la comparación del tamaño de los cromosomas sexuales entre los individuos con sistema simple y aquellos con sistema múltiple. Otra particularidad que comparten estas poblaciones es que en los individuos con sistemas múltiples, los cromosomas sexuales mostraron dos tipos de asociación en metafase II: por un lado, la que se observa comúnmente en los heterópteros con los cromosomas Xs orientados hacia un polo y el cromosoma Y hacia el polo contrario, i.e. doble placa y, por otro, dispuestos en cadena, donde uno de los cromosomas sexuales quedaba en el medio y migraba retrasado aunque, finalmente, llegaba a los polos correctamente (Heizer, 1950; Papeschi, 1996). Se ha sugerido que este último tipo de asociación en cadena sería evolutivamente inestable y que existiría una tendencia hacia el establecimiento de una disposición de doble placa (Darlington, 1939b). En el caso de
Z. femoralis
longispinis
se observó siempre que los cromosomas sexuales se disponen en doble placa en metafase II; por ello, podría considerarse que el sistema múltiple de los individuos de esta población sería estable. Esta configuración meiótica junto con la frecuencia de los individuos que poseen el sistema múltiple (dos de los cuatro individuos analizados), la presencia del polimorfismo a través de los años (2008 y 2011) y el comportamiento altamente regular del cromosoma extra, indicarían que este citotipo es neutral o, al menos, no perjudicial y que su origen no habría acontecido tan recientemente. Por último, cabe destacar que sería de suma utilidad estudiar más ejemplares machos deZ. femoralis longispinis
, incluir ejemplares hembras y analizar la frecuencia de individuos con sistema múltiple y con sistema simple en años sucesivos de manera de hacer más robustas las hipótesis aquí propuestas.CAPITULO VI Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 152 | P á g i n a
B. ALTERACIONES ESTRUCTURALES
INTRODUCCIÓN La dificultad en la detección de variaciones estructurales en los cromosomas holocinéticos se debe tanto a la falta de diferenciación cromosómica como a la escasa diferenciación longitudinal de este tipo de cromosomas. Es por esto que los reordenamientos cromosómicos, como inversiones y translocaciones recíprocas, han sido sólo descriptos en unas pocas especies de diferentes grupos con cromosomas holocinéticos (Juncaceae, Heteroptera, Homoptera, Scorpionida) (Blackman et al., 1995; Blackman y Takada, 1975, 1977; Bressa et al., 1998; Castro et al., 1954; Nordenskiöld, 1963; Papeschi y Mola, 1990; Pérez et al., 2004; Piza, 1948, 1951, 1957b; Shanahan, 1989; Takahashi, 1976). Los reordenamientos cromosómicos detectados hasta el presente son debidos, casi exclusivamente, a variaciones en el número de cromosomas. Aunque cada cambio cromosómico tiene que pasar por una fase polimórfica antes de que se establezca en una población, los polimorfismos cromosómicos, o incluso la aparición de individuos heterocigotas estructurales, rara vez se han detectado en las poblaciones naturales de organismos con cromosomas holocinéticos (Manna, 1984; Ueshima, 1979). Hasta el presente, sólo se han descripto reordenamientos cromosómicos en cuatro especies de Heteroptera provenientes de poblaciones naturales. Todos los casos mostraron irregularidades cromosómicas y/o una disminución en el número de espermátidas viables (Bressa et al., 1998; Papeschi, 1994; Papeschi y Mola, 1990; Pérez et al., 2004).
Los polimorfismos y politipismos dados por fragmentaciones cromosómicas, o bien fusiones, pueden implicar tanto autosomas como cromosomas sexuales (Manna, 1984); como resultado de estos reordenamientos se pueden originar cromosomas extras (Pérez et al., 2004). Los cromosomas B son cromosomas dispensables y adicionales que están presentes en algunos individuos de algunas poblaciones de algunas especies y que no recombinan con ninguno de los cromosomas A del complemento, por lo que podrían seguir su propio camino evolutivo (Camacho et al., 2000). Han sido propuestos diferentes orígenes para estos cromosomas supernumerarios o extras: i) origen a partir de cromosomas autosómicos (Jones y Rees, 1982), ii) origen a partir de cromosomas sexuales (Hewitt, 1973) u iii) origen a partir de hibridación interespecífica (Battaglia, 1964).
Las especies de Triatominae se caracterizan por un número diploide que varía de 21 a 25, siendo la moda 2n=22=20A+XY (macho) (Panzera et al., 2010; Panzera et al., 1998; Ueshima, 1979). La variación en el número diploide se debe principalmente a la presencia de sistemas de cromosomas sexuales simples y múltiples: XY, X1X2Y y X1X2X3Y (macho) (Panzera et al., 2010). Por
otra parte, una de las características más distintivas en la meiosis de los machos de los triatominos es la existencia de un cuerpo heteropicnótico positivo formado por los cromosomas sexuales, a los
CAPITULO VI Poggio, María Georgina
Estudios citogenéticos y evolutivos en especies de Cimicomorpha 153 | P á g i n a
que también pueden estar asociados aquellos autosomas con bloques heterocromáticos. A este cuerpo se lo denomina cromocentro y se puede observar durante la profase I (De Vaio et al., 1985; García Tavares y Vilela de Azeredo-Oliveira, 1997; Panzera et al., 1995; Pérez et al., 1992; Solari, 1979).
Triatoma infestans
posee 2n=20A+XY/XX (macho/hembra), con tres pares de autosomas de mayor tamaño que presentan bloques heterocromáticos terminales conspicuos. Estos tres pares autosómicos junto a los cromosomas sexuales son heteropicnóticos positivos durante la profase I meiótica y se encuentran íntimamente asociados formando un gran cromocentro (Barth, 1956; Schreiber y Pellegrino, 1950; Solari, 1979; Ueshima, 1966b). Panzera y colaboradores (2004) identificaron en esta especie dos grupos cromosómicos diferentes a los que llamaron grupo Andino y grupo No Andino. Las diferencias entre ambos grupos comprenden el número y tamaño de bloques heterocromáticos en los autosomas y la localización de estos bloques en uno o ambos extremos del cromosoma. Además, sólo se detectó la presencia de tres pares autosómicos con heterocromatina en el grupo No Andino.RESULTADOS