Students’ Interview

Se parte de una cepa Hfr de Eschericia coli que es sensible a la tetraciclina y prototrofa para Prolina (Pro) e Histidina (His), y se cruza con una cepa receptora resistente a tetraciclina pero auxotrofa para los mismos marcadores. Responde a las siguientes cuestiones:

¿Qué es una cepa Hfr?

¿Qué proceso genético se producirá entre ambas?

¿Qué característica debe cumplir la cepa receptora para que se produzca dicho fenómeno? Define qué es un mutante auxotrofo

C/ Introducción a la Ingeniería Genética: (Láminas B)

1 Generalidades sobre Ingeniería Genética; Enzimas de Restricción:

- Muchos procesos de transferencia de información genética entre bacterias son fundamentales para la industria, ya que permiten la modificación de procesos naturales por el humano con fines productivos.

- Se define como la formación In-Vitro de nuevas combinaciones de material genético por medio de la inserción de un ADN de interés, en un Vehículo Genético o Vector de Clonación, de tal manera que tras su introducción en un organismo huésped este ADN se pueda multiplicar y propagar, y pueda expresar sus genes, cuyos productos nos interesan.

- Las Enzimas de Restricción de las bacterias son indispensables para llevar estos procesos a buen término. Se trata de Enzimas Endonucleasas creadas exclusivamente por bacterias que reconocen secuencias pudiendo cortarlas de forma específica (I).

- Estas enzimas forman parte del Sistema RM (restricción-modificación) natural de las bacterias para defenderse ante ADN exógeno no reconocido. Este sistema tiene además la capacidad de modificación por metilación del ADN propio, con el fin de evitar que dichas enzimas corten el ADN propio.

- Se distinguen, en función de su forma de cortar la cadena de ADN, tres tipos de Enzimas de Restricción:

 Tipo I: (ATP, Mg2+_{) Reconoce secuencias asimétricas, produciendo cortes a más de 100}

pares de bases de estas.

 Tipo II: (Mg2+_{) Reconoce una secuencia Palindrómica (simétrica) realizando un corte exacto}

en ella. Puede ser un corte Protuberante (desigual) (I) o Romo (liso, recto). En caso de corte protuberante, el extremo cohesivo puede ser 5’ o 3’ (se trata del más corto de la secuencia palindrómica).

 Tipo III: (ATP, Mg2+_{) Reconoce secuencias asimétricas, produciendo cortes a unos 30 pares}

de bases de estas.

- Entre ellas, las más interesantes para la Ingeniería genética son las de Tipo II. El tipo de corte que realiza (Romo o Protuberante de extremo cohesivo 5’ o 3’), pues debemos lograr el mismo corte exacto en las secuencias de ADN de interés y donde vamos a insertar este. Se suelen utilizar cortes protuberantes

- En cuanto a su nomenclatura, alude a la bacteria en la que ha sido aislada por primera vez, por ejemplo:

 EcoR I (Escherichiacoli, Cepa R, nº1).

 BamH I (Bacillusamilolicuefaciens, Cepa H, nº1).

- El primer paso es estudiar la secuencia del gen en el que estamos interesados, y detectar todas las Secuencias de Restricción con que cuenta para cada enzima. Este trabajo está informatizado.

- Así podemos seleccionar la Enzima adecuada para escindir un gen concreto deseado, sin destruirlo, que deberá ser la misma que escinda el ADN del Vector de Clonación, u otra que realice cortes con extremos cohesivos idénticos. Seleccionamos de entre los fragmentos el que nos interesa, aislandolo por cromatografía o electroforesis.

- El Vector de Clonación es el elemento genético que nos permite introducir nuestro fragmento de ADN de interés en un organismo huésped. Se suelen emplear Plásmidos Artificiales, Baceriófagos, Cósmidos (plásmido + bacteriófago) o Vectores de Alta Capacidad.

- Finalmente podremos así clonar nuestro ADN en el Vector, que deberá ser cortado con extremos idénticos a los del fragmento de interés. Ambos fragmentos serán recombinados con ayuda de una ADN ligasa.

- Por último se introduce el Vector clonado en un Organismo Huésped: Bacterias, Levaduras, y en ocasiones células eucariontes vegetales o animales.

- En bacterias, el plásmido es introducido por transformación, forzando un estado de competencia artificial gracias a elecroporación o utilizando CaCl2.

- Debido al Sistema RM (Rec), la mayoría de bacterias modifica o escinde el fragmento de ADN introducido como método de defensa. Estas reciben el nombre de Rec +. Las pocas bacterias que llegan al final del proceso y contienen el plásmido en su interior son Rec -; el Sstema RM debe ser eliminado de las bacterias utilizadas.

- En células Eucariontes, esta información puede ser introducida por dos vías: Mediante infección por Virus, o con Pistola de Genes. En el caso de levaduras puede también lograrse por electroporación.

2 Vectores de Clonación; Plásmidos Artificiales:

- Los Plásmidos Naturales presentan una serie de desventajas: Para comenzar pueden presentar región tra y ser movilizables. No nos interesa la transferencia horizontal de genes, sino simplemente la transferencia vertical (a la descendencia). Además no contienen marcadores seleccionables en placa, como Resistencia a Antibióticos. No suelen poder introducir más de 10 kPB. Por ello se generan Plásmidos Artificiales, como pBR 322 (V), o pUC 18.

- Para comenzar, debemos eliminar los genes tra para evitar la recombinación.

- La Región Polilinker es una región que se incluye siempre en los plásmidos artificiales, con genes de resistencia (o nutricional), en la que se pueden insertar los fragmentos de interés ya que posee una gran cantidad de secuencias de escisión para múltiples enzimas.

- Para comprobar que un plásmido ha sido clonado correctamente, la Inactivación Insercional de la Región Polilinker, por inserción del fragmento de interés, facilita el reconocimiento de plásmidos que han insertado correctamente dicho fragmento, ya que las bacterias portadoras pierden su resistencia (o capacidad nutricional) (VI).

- Por ejemplo, la Inactivación Insercional de la región polilinker que contiene el gen Lac Z para -Galactosidasa, clonados e insertados en bacterias que son cultivadas en Medio X-Gal, es responsable de la formación de colonias bacterianas de color azul, mientras que las que contienen el gen Lac-Z intacto forman colonias de color blanco, visiblemente distinguibles (VII, VIII).

3 Otros Vectores de Clonación:

- Los Fagos son de fácil manejo pero sólo aceptan genes de pequeño tamaño (10kPB). Los Fagos - Cósmidos son más difíciles de manejar, pero permiten trabajar con ADN de mayor tamaño (20-30 kPB).

Región Polilinker

- El Fago Lambda produce en el interior celular un gran número de copias de su información genética y de las proteínas de su cápsida. Sin embargo el tamaño de su cápsida es limitado y no puede contener mucha información. Para utilizarlo en ingeniería genética deben ser eliminadas partes no indispensables de su ADN para poder introducir el fragmento de interés (IX).

- Se ha insertado un gen -Gal con Región Polilinker en la cadena de ADN de Fagos Lambda. Deben ser cultivados en una placa sobre césped de bacterias, de forma que se crean halos de lisis (X).

- El Cósmido es un vector plasmídico con Sitios Cos (extremos cohesivos del genoma del Fago Lambda), de tal manera que dichos plásmidos son empaquetados en los viriones y fagos (IX). - Los Vectores de Alta Capacidad son vectores para fragmentos de más de 100 kPB. Entre ellos se encuentran los Cromosomas Bacterianos Artificiales (BAC) basados en el plásmido pF, y los Cromosomas Artificiales de Levaduras (YAC) derivados de un cromosoma de levadura.

4 Técnicas de Rastreo:

- Se trata de técnicas previstas para diferenciar las bacterias que han incorporado correctamente el fragmento de ADN de interés y no lo han modificado, al final del proceso.

- Puede realizarse por Resistencia a Antibióticos, utilizando un vector que contiene un gen de Resistencia independiente de la región Polilinker (V, VI; Resistencia a Ampicilina). Sólo las bacterias que han incorporado el Vector podrán crecer en un Medio con dicho Antibiótico.

- Puede realizarse por Hibridación del plásmido y en ADN bacteriano, inducida por Sondas, combinado con el método de Resistencia a Antibióticos.

- Puede también realizarse un Rastreo por Ensayo Inmunológico. Se utilizan Anticuerpos Marcados específicos para una proteína.

Parte II; VIROLOGÍA