Studies that Analyze Efficiency

Como se ha explicado, los componentes de la respuesta celular y humoral son igualmente importantes en la defensa frente a ECTV. En los ratones susceptibles como BALB/c, ECTV consigue bloquear la débil reacción de tipo Th1 de este hospedador tan importante en la defensa contra este patógeno. En este contexto, se ha podido analizar la contribución de la regulación inmunológica de algunos genes de ECTV. El IFNγ es una citoquina que forma una parte importante de la respuesta innata y de las funciones efectoras de células NK. Es una molécula importante en la defensa frente a Poxvirus ya que ratones resistentes B6 se vuelven susceptibles a ECTV cuando son delecionados de IFNγ (Karupiah y cols., 1993). Para contrarrestar su acción, VARV, ECTV y VACV expresan una proteína, vIFNγR, similar al receptor celular de esta citoquina. Modelos de infección con recombinantes de VACV carentes de la vIFNγR han dado resultados contradictorios (Symons y cols., 2002; Verardi y cols., 2001). Sin embargo, el virus ECTV ∆vIFNγR manifestó un fenotipo discreto pero significativamente atenuado respecto al virus parental en ratones susceptibles, con una supervivencia del 90% de los animales infectados con 500 ufp (Sakala y cols., 2007), sugiriendo un papel para esta proteína en la modulación de la respuesta del hospedador in vivo.

Detrás de la inducción del IFNγ se encuentran la IL-18 y la subunidad p40 de la IL-12 y la IL-23 (Yoshimoto y cols., 1997). Ratones B6 deficientes en IL-18 y IL-12 fueron susceptibles a la infección subcutánea con altas dosis de ECTV con un menor nivel de citoquinas asociadas a la respuesta Th1 y respuesta CTL y NK reducida (Wang y cols., 2009). ECTV ha diseñado una molécula, similar a la proteína reguladora de la actividad de la IL-18, la IL-18BP, para inhibir los efectos de esta IL. Se ha demostrado, tanto in vitro como in

vivo, que la vIL-18BP es capaz de atenuar la actividad NK pero no parece ser un factor de virulencia esencial

en la patogénesis de ECTV en este modelo (Born y cols., 2000).

Por contra, la vIFN-IBP resultó ser un factor de virulencia esencial en ECTV (Xu y cols., 2008). El IFN de tipo I es importante para el establecimiento de un estado anti-viral en las células y limitar así la infectividad del virus. Ratones B6 resistentes a ECTV, son susceptibles a la infección cuando son delecionados de los receptores celulares del IFN de tipo I (Gratz y cols., 2011). La eliminación de la vIFN-IBP de VACV, B18, resultó en una atenuación de dos órdenes de magnitud en la DL50 en un modelo intranasal (Symons y cols.,

1995). Sin embargo, en ECTV supuso una atenuación mayor a 7 órdenes de magnitud en comparación con el virus parental en ratones susceptibles infectados por vía subcutánea (Xu y cols., 2008). Además, la administración de vIFN-IBP recombinante previa a la infección con ECTV protegió a los animales (Xu y cols., 2008). De igual forma, el suero de ratones inmunizados con vIFN-IBP recombinante protegió de la infección a ratones susceptibles. Un estudio reciente demuestra que la vIFN-IBP inhibe localmente en el hígado y bazo el efecto anti-viral del IFN de tipo I favoreciendo la replicación de ECTV (Xu y cols., 2012). Este estudio también demuestra que el tratamiento con anticuerpos contra la vIFN-IBP protege a los ratones infectados con ECTV, planteando la posibilidad de diseñar estrategias frente a proteínas inmunomoduladoras para proteger de infecciones de poxvirus.

N1 es un proteína codificada por VACV, ECTV y VARV similar al factor antiapoptótico Bcl-2 y se piensa que podría bloquear la apoptosis celular para permitir la expansión del virus (Aoyagi y cols., 2007). La atenuación de ECTV ∆N1 observada por inoculación intranasal, fue similar a la obtenida en un modelo de VACV (Bartlett y cols., 2002). ECTV ∆N1 es además incapaz de abandonar los pulmones ya que durante la infección no se detectó carga viral en los órganos linfoides secundarios (Gratz y cols., 2011). Esto sugiere que en ausencia de N1, el virus es eliminado rápidamente de los pulmones por la respuesta innata. Sin embargo, la atenuación observada fue moderada, de dos órdenes de magnitud respecto al virus parental.

CrmA es una proteína implicada en la inhibición de la cascada de las caspasas que afecta tanto a las señales de apoptosis, como a los procesos inflamatorios en los que las procitoquinas necesitan ser procesadas por caspasas para dar lugar a las formas activas (Kettle y cols., 1997). Un mutante de ECTV deficiente en este gen dio lugar a un fenotipo atenuado en el que el 80% de los animales infectados por vía subcutánea sobrevivieron (Melo-Silva y cols., 2011). Sin embargo, la depleción de las células NK revirtió el efecto y todos los animales sucumbieron a la infección por el mutante de deleción. Esto sugiere, que el efecto de CrmA podría estar focalizado en reducir la actividad de las células NK.

El papel del vTNFR homólogo del CD30 expresado por ECTV, vCD30, también ha sido estudiado in vivo. La deleción de esta proteína no afectó a la virulencia de ECTV en un modelo intranasal (Alejo y cols., 2009). Aunque es indiscutible el papel del TNFα en la defensa ante las infecciones virales, son pocos los datos que se tienen sobre su efecto en la respuesta inmunológica contra Poxvirus. El mejor ejemplo es el de M-T2, el vTNFR de MYXV, cuya deleción supuso una atenuación moderada del virus en un modelo de conejos europeos (Upton y cols., 1991). Se ha sugerido que el TNFα tiene una función importante pero no tan esencial como el IFNγ. Ya que, mientras que la depleción de éste último tiene un efecto letal en ratones B6 infectados con ECTV, la inactivación del TNFα mediante anticuerpos específicos no evitó el establecimiento de fuertes respuestas NK y CTLs y la supervivencia de los ratones no se vio afectada (Chaudhri y cols., 2004). Sin embargo, la sobreexpresión de TNFα mediante un recombinante de VACV para la expresión de esta citoquina, controló la expansión viral, un fenotipo que probablemente se deba al efecto citotóxico local mediado por el TNFR1 (Sambhi y cols., 1991). Aunque la mayor parte de los procesos inmunológicos inducidos por el TNFα están mediados por el TNFR1 (Schluter y Deckert, 2000), en el caso de la defensa ante una infección por ECTV se le ha atribuido un papel especialmente importante al TNFR2. Ratones B6 deficientes en TNFR1, aunque mostraron síntomas más graves que los ratones parentales, sobrevivieron perfectamente a la infección por vía subcutánea, sin embargo, aquellos ratones que carecían del TNFR2 fueron altamente susceptibles, con un 80% de mortalidad al inocular 5.000 ufp (Ruby y cols., 1997). La importancia del TNFR2 va en consonancia con el hecho de que los vTNFRs de Poxvirus tengan un mayor grado de similitud con este receptor. Sin embargo, excepto algunos experimentos en el modelo de VACV y en mucho casos en presencia de otros inhibidores del TNFα, se conoce muy poco del papel que podrían tener en patogénesis, los vTNFRs, CrmB, CrmC, CrmD y CrmE.

La deleción de CrmB en un modelo intracraneal de CPXV, resultó en una atenuación de casi dos órdenes de magnitud respecto al virus parental (Hu y cols., 1994). Sin embargo, este experimento intracraneal difícilmente puede reproducir la infección natural de este virus. Además, se estudió el efecto de la eliminación del gen de CrmB en un contexto en el que existen otros vTNFRs activos como CrmE y CrmC. Por lo tanto, aunque este resultado sugiere una función importante para CrmB, el modelo en el que se estudió no es el adecuado para determinar la importancia de esta proteína en patogénesis. El papel de CrmE y CrmC se ha estudiado en modelos de deleción de los correspondientes genes de VACV cepa USSR (Reading y cols., 2002). En ambos casos se registró una leve atenuación del fenotipo viral, sin embargo, estos trabajos tenían el problema de partir de un virus parental muy atenuado y por lo tanto, poco margen para detectar cambios en la virulencia. En otra aproximación diferente, la incorporación de los genes de CPXV que codifican CrmB, CrmC o CrmE al genoma de un VACV cepa Western Reserve TK-, aportó un incremento marginal de la virulencia a un virus altamente atenuado (Reading y cols., 2002). Sin embargo, nuevamente, se trataba de un modelo muy limitado para el estudio de las funciones inmunomoduladoras de estos vTNFRs. CrmD es la única molécula anti-TNFα expresada por ECTV, un patógeno estricto de ratón. Por lo tanto, el estudio del efecto de la deleción del gen de CrmD en un modelo en el que se utiliza el hospedador y la ruta de entrada natural de ECTV, podría aportar información relevante sobre el papel de este vTNFR en la patogénesis de

Los poxvirus han desarrollado multitud de estrategias para la regulación de la respuesta inmunológica de sus hospedadores. Mediante estos mecanismos, los virus consiguen evadir la respuesta anti-viral y garantizar su propagación y supervivencia. Por ejemplo, la expresión de receptores solubles o proteínas de unión a citoquinas, permiten a estos virus interferir con las funciones de factores tan importantes en la respuesta inmunológica como el TNFα o las CKs.

El TNFα es una molécula con importantes funciones proinflamatorias. Los poxvirus han diseñado distintas estrategias para el bloqueo de esta citoquina, lo que resalta su importancia en la respuesta anti-viral. Uno de estos mecanismos anti-TNFα es la expresión de vTNFRs, proteínas solubles que mimetizan el dominio de unión al ligando de los TNFRs celulares. Entre las especies de poxvirus, se han descrito cuatro tipos distintos de vTNFRs: CrmB, CrmC, CrmD y CrmE. Todavía no se entiende bien por qué estos vTNFRs son expresados de manera diferencial entre los distintos poxvirus. Así, mientras que virus con un amplio rango de hospedador, como algunas cepas de CPXV, contienen genes para la expresión de todos los vTNFRs, VARV, un virus exclusivamente humano y ECTV, que sólo infecta ratones, únicamente expresan CrmB y CrmD, respectivamente. Hasta la fecha, no se han conseguido datos definitivos que aclaren el papel de estos vTNFRs en la patogénesis de poxvirus.

A diferencia de CrmC y CrmE, CrmB y CrmD contienen además un dominio SECRET para la unión de un pequeño grupo de CKs. Por lo tanto, son proteínas con una doble actividad inmunomoduladora, anti-TNFα y anti-CKs. Se desconoce el papel de este dominio SECRET en la patogénesis de poxvirus, una familia de virus que ya contiene otros genes para la inhibición de las funciones de las CKs. Sin embargo, dado que el virus delecionado de CrmD está altamente atenuado y que los únicos vTNFRs codificados por virus muy virulentos como VARV y ECTV, son precisamente CrmB y CrmD, la actividad del dominio SECRET podría resultar muy relevante para la propagación de estos virus en sus hospedadores.

Cada vez se conocen mejor las bases estructurales de la interacción del TNFα con sus TNFRs celulares. Sin embargo, existe muy poca información acerca de la unión de los vTNFRs al TNFα. La caracterización de las estrategias moleculares llevadas a cabo por los vTNFRs para inhibir el TNFα, podría aportar datos de gran relevancia para el diseño de nuevas drogas utilizadas en el tratamiento de algunos trastornos inflamatorios mediados por el TNFα. En este mismo sentido y tomando como referencia las proteínas de poxvirus, CrmB y CrmD, la adición de un dominio SECRET a los medicamentos anti-TNFα podría aportar importantes ventajas terapeúticas. Para ello, se necesita conocer muy bien las características moleculares, así como el papel en patogénesis de este dominio anti-CKs.

En este escenario, los objetivos planteados en esta Tesis fueron los siguientes: