Suggestions for future work

Las células mononucleares en sangre periférica (CMSP), se aislaron a partir de 20 ml de sangre heparinizada mediante centrifugación en gradiente de ficoll. Tras lavar las células con PBS 1x, se resuspenden en 5 ml de Kcl 0,56% durante 10 minutos a 37ºC, con objeto de producir un choque hipotónico en las células y provocar que éstas se hinchen. Tras cinco minutos de centrifugación a 1300 rpm se quita el sobrenadante y el precipitado de células se resuspenden en PBS 1×. A continuación se mezclan 15 µl de las células resuspendidas con 35 µl de agarosa de bajo punto de fusión al 1% y la mezcla se deposita sobre portaobjetos, previamente recubierto con una fina capa de agarosa convencional al 0,65%. Posteriormente, se coloca un cubreobjetos y se deja gelificar a 4ºC sobre una bandeja metálica durante una hora. A continuación, se quitan los cubreobjetos sumergiendo las preparaciones en PBS 1× e incubándolas en etanoles al 30% y al 70% durante 5 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, las preparaciones se incuban en etanol absoluto durante 30 minutos a temperatura ambiente para permeabilizar las membranas celulares y se dejan secar durante al menos 30 minutos.

La hibridación se realizó con la misma sonda empleada para la detección de VIH en mucosa bucal (generada a partir del plásmido pVIHgag) y se llevó a cabo en cámara húmeda durante 16 horas a 42ºC.

Tras la hibridación, el exceso de sonda se eliminó mediante 2 lavados en 2×SSC. Posteriormente se incuban las preparaciones en RNAsa A (20µg/ml) (Roche Molecular Biochemicals) para eliminar el RNA que no haya hibridado. Finalmente, realizaron lavados en concentraciones decrecientes de SSC.

La detección de la hibridación in situ se llevó a cabo mediante microscopía de fluorescencia. Los híbridos se detectaron incubando las preparaciones con un anticuerpo antidigoxigenina conjugada con fluoresceína (fluoresce en luz verde) en cámara húmeda a 37ºC durante una hora (Roche Molecular Biochemicals). En algunos casos, el revelado se realizó con estreptavidina conjugada con rodamina (fluoresce en rojo) en cámara húmeda a 37ºC durante una hora (Roche Molecular Biochemicals).

Finalmente, las preparaciones se contrateñían con DAPI (5-10ng/ml) y eran montadas en solución antifade.

En todos los casos se realizaron los siguientes controles para asegurar la especificidad de las señales de hibridación:

Hibridación con un plásmido marcado que contiene secuencias no relacionadas del VIH; tratamiento previo de las preparaciones con Rnasa o Dnasa; omisión de la sonda en la mezcla de hibridación.

 Test de saliva: la paleta en la cual se tomaba la muestra de saliva, se insertaba en el frasco con la solución reveladora, la cual permite la detección de anticuerpos anti VIH1/2. Se dejaba en reposo la paleta durante un mínimo de 20 minutos pero no sobrepasando los 40 minutos. La paleta tiene una ventana en la cual se ve el resultado de la prueba. Siempre debe aparecer una línea de color púrpura junto al triángulo que dice “C” (control), esto indica la validez de la prueba. El resultado es reactivo (positivo), si aparece una línea de color púrpura junto al triángulo que dice “C” y también si aparece otra línea de color púrpura junto al triángulo que dice “T” (test), lo cual nos indica que la muestra de saliva contiene anticuerpos que reaccionan con los antígenos. El resultado es negativo, si aparece una línea de color púrpura únicamente donde dice “C” y no donde dice “T”.

Figura 3: Interpretación del resultado del Test Oraquick Advanced.

Estudio 3:

 Frotis faríngeo: Se tomaron las muestras faríngeas con hisopo estéril, con un medio de trasporte se llevaron al laboratorio y se cultivaron dentro de las siguientes 2 horas en un medio selectivo de agar chocolate suplementado con PolyVitex VCAT3 (Biomérieux, Marcy-l’Etoile, France). Se

realizó la identificación mediante métodos convencionales y API NH (Biomerieux®). Se determinó la susceptibilidad antibiótica mediante E-test.

2.3 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

El estudio estadístico se llevó a cabo en el Centro de Investigación y Proceso de Datos de la Universidad Complutense. El análisis estadístico de los datos se realizó con el programa SPSS 19.0 para Windows.

Los métodos estadísticos utilizados fueron los siguientes (SPSS, 2010):

Estudio 1:

 Sobre los 20 pacientes que intervinieron en el estudio anatomopatológico y serológico, se empleó el test de Pearson para ver las correlaciones entre las distintas variables: CD4, CD8, cociente CD4/CD8 y el porcentaje de virus en mucosa. Se empleó el test de Anova de un factor para estudiar la relación entre el estadío inmunológico del paciente con el porcentaje de virus en mucosa.

 También se empleó el test de la T de Student para analizar datos cuantitativos y el test de Spearman para ver la correlación. El valor se consideró estadísticamente significativo para una p>0,05. Todos los análisis se realizaron utilizando el programa SPSS (SPSS para Windows 9.0, SPSS Inc. Chicago IL).

 Estadística descriptiva de las variables cuantitativas: edad, carga viral, células CD4, células CD8, cociente CD4/CD8, plaquetas, hemoglobina, etc… (procedimiento DESCRIPTIVE) para la descripción de las muestras: media, desviación estándar, máximo, mínimo, mediana, desviación estándar de la media, etc.

 Estadística descriptiva de las variables cualitativas: sexo, vía de contagio, estadío CDC, enfermedades de transmisión sexual (ETS), hábitos tóxicos, tratamiento antirretroviral, lesión oral, presencia de gonococo, sensibilidad a antibióticos, test de saliva, etc… (procedimiento FREQUENCIES), con la obtención de frecuencias y porcentajes de las categorías.

 Test de la T de Student (procedimiento T-TEST) para la comparación de dos medias (hombre y mujer) en variables cuantitativas, asumiendo o no igualdad de varianzas (método paramétrico). Se asume la normalidad en los datos. La igualdad de varianzas se contrasta con el test de Levene (lo que nos indicará si es más adecuado el test asumiendo varianzas iguales o desiguales).

 Tablas de contingencia para la relación entre variables cualitativas (procedimiento CROSSTABS). Test de la chi-cuadrado (χ2_{) para contrastar}

la independencia o influencia entre dos variables cualitativas, donde se emplea el test de la chi-cuadrado de Pearson con información en cada casilla de la tabla de contingencia del porcentaje en fila y los residuos corregidos no tipificados para ayudar a descubrir las tramas en los datos que contribuyen a una prueba de chi-cuadrado significativa.

Resultados

Epidemiología descriptiva: Estudio 1:

De los 17 sobre los que finalmente se realizó el estudio anatomopatológico y serológico, 3 eran mujeres (17,65%) y 14 eran hombres (82,35%) (figura 1).

Figura 1: Afectación del VIH-1 en función del sexo.

La edad media de afectación del VIH es de 38,25 años en el grupo de los hombres y de 35,33 años en las mujeres. El rango de edades de los pacientes estudiados: 27-67 años.

La forma de contagio de los pacientes estudiados es (figura 2): • ADVP: 65,52%, 11 pacientes, 9 hombres y 2 mujeres. • Homosexual: 20,69%, 4 pacientes hombres.

14   3   0   5   10   15   Hombres   Mujeres  

Sexo  

• Heterosexual: 13,79%, 2 pacientes, una mujer y un hombre.

Figura 2: Porcentajes de los mecanismos de transmisión del VIH.

8 de los 17 pacientes presentaban manifestaciones orales relacionadas con la infección por VIH (figura 3).

Figura 3: Patología oral asociada al VIH.

15 de 17 pacientes, estaban recibiendo tratamiento antirretroviral (figura 4).

65%   12%  

23%