3
33
3---- MATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOSMATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS
3.1
3.1
3.1
3.1---- Descripción de la planta pilotoDescripción de la planta pilotoDescripción de la planta pilotoDescripción de la planta piloto
La planta piloto consiste en un sistema de fangos activados, en el que diferenciamos las siguientes partes (Figura 12):
- Depósito de agua de entrada
- Equipo planta piloto de bombas peristálticas - Reactor biológico
- Agitador mecánico
- Controlador y sondas de medida - Decantador secundario
- Depósito de agua de salida
Depósito de agua de entrada: Se trata de un tanque de alimentación de agua influente con una capacidad para 50 litros. El agua residual utilizada es sintética porque facilita el control del proceso, ya que no tienen lugar variaciones inesperadas en la composición y concentración, y evita otros posibles problemas como inhibiciones. El depósito se encuentra aislado de la luz solar para evitar la proliferación de algas. La composición del agua residual sintética de entrada (Tabla 6) se prepara tres veces por semana.
Tabla Tabla Tabla
Tabla 6666---- Composición agua residual sintéticaComposición agua residual sintéticaComposición agua residual sintética Composición agua residual sintética
AGUA RESIDUAL SINTÉTICA AGUA RESIDUAL SINTÉTICA AGUA RESIDUAL SINTÉTICA AGUA RESIDUAL SINTÉTICA Compuesto
Compuesto Compuesto
Compuesto ConcentraciónConcentraciónConcentraciónConcentración ((((mg/lmg/lmg/l)))) mg/l
CH3COONa 250 NH4Cl 150 Na2HPO4•12H2O 37,5 K2PO4 12,5 KCl 8,74 CaCl2•2H2O 8,74 MgSO4•7H2O 7,3 FeSO4•7H2O 1,26 ZnCl2 0,2 CoCl2 0,2
Equipo planta piloto bombas peristálticas: Se trata del equipo piloto
“Bio Kontroll
mark 2”
(Figura 13), el cual consta de dos bombas peristálticas con posibilidad de funcionar en continuo, o bien, alternando ciclos de operación y espera regulables en diez velocidades cada uno de ellos.Este equipo bombea con la bomba A, desde el depósito de agua de entrada hasta el reactor biológico, y con la bomba B, la recirculación de fangos externa del decantador secundario al reactor biológico.
Figura Figura Figura
Figura 121212---- Foto Planta Piloto12 Foto Planta PilotoFoto Planta PilotoFoto Planta Piloto
Reactor biológico: El reactor biológico es un tanque de metacrilato de 40 litros de capacidad el cual, tiene dos entradas de agua por la parte inferior, para la introducción del agua influente y la recirculación, y cuatro salidas a diferentes alturas correspondiendo con 18 litros de volumen la salida utilizada y utilizando el resto de salidas superiores como reboses de seguridad. La aireación del reactor es llevada a cabo por cuatro difusores de pecera, formando ángulos entre sí de 90º en el fondo del reactor. El bombeo de aire se lleva a cabo a través de un aireador de pecera.
Agitador mecánico: El reactor biológico posee también una agitación mecánica a través de una pala que gira a través de un taladro mecánico con velocidades regulables.
Controlador y sondas de medida: La instrumentación utilizada parte de un controlador SC200 (
Hach Lange
) que controla las dos sondas instaladas en el reactor biológico, una de pH y otra de oxígeno. Esta última se encuentra conectada por relé al aireador de pecera para controlar la consigna de oxígeno fijada. El registro de datos de pH, temperatura y oxígeno se almacena cada minuto, obteniendo el valor medio alcanzado en dicho tiempo de cada medida.Además el aireador y la agitación mecánica se encuentran conectados a un reloj temporizador que marca los ciclos de aireación intermitente.
Decantador secundario: El agua de salida del reactor fluye por gravedad al decantador secundario de metacrilato con una capacidad de volumen de 5 litros. Dicho decantador tiene forma troncocónica y es estático. Posee dos salidas una inferior para la recirculación de fangos al reactor biológico, a través de la bomba B y otra superior para el agua efluente a través de un deflector.
Depósito de agua de salida: Recoge el efluente del decantador secundario que fluye por gravedad a este depósito. Se trata de un tanque de almacenamiento de agua con una capacidad para 50 litros, que permite tener una muestra de salida integrada.
3.2
3.2
3.2
3.2---- Antecedentes: Prediseño, montaje y puesta en marcha de la planta Antecedentes: Prediseño, montaje y puesta en marcha de la planta Antecedentes: Prediseño, montaje y puesta en marcha de la planta Antecedentes: Prediseño, montaje y puesta en marcha de la planta
piloto.
piloto.
piloto.
piloto.
En un primer momento antes de comenzar la realización del proyecto, se llevó a cabo un prediseño del reactor biológico y sus parámetros operacionales mediante una plantilla Excel, con el objetivo de obtener los parámetros cinéticos resultantes, así como la calidad del agua de salida. Los parámetros de diseño empleados fueron los siguientes:
Tabla Tabla Tabla
Tabla 7777---- Parámetros de diseño inicialesParámetros de diseño inicialesParámetros de diseño inicialesParámetros de diseño iniciales
También estos parámetros sirvieron para el diseño del reactor biológico de metacrilato, el cual, todavía estaba pendiente de construir. Así pues, se diseñó el reactor de metacrilato en función de los volúmenes y caudales previstos, de forma que este volumen coincidiera con una de las salidas, disponiendo también de otras salidas a distintos volúmenes de trabajo, tanto superiores como inferiores por si fuera necesaria su utilización. Q entrada 40 l/d Volumen reactor 25 l TRC 9 días SS 2500 mg/l DQO entrada 300 mg/l DQO salida 25 mg/l
Se trabajó con el equipo piloto de bombas peristálticas “
Bio Kontroll mark 2
” para llevar a cabo la calibración de los caudales de ambas bombas, ya que el funcionamiento semicontinuo de este equipo presenta 10 posiciones de operación y 10 posiciones de espera, por lo que cada bomba cuenta con 100 posibles caudales. Se calibraron un 40% de los caudales de cada bomba, para tener un amplio margen de posibilidades en los caudales de entrada y recirculación (Figura 13).Figura Figura Figura
Figura 13131313---- Foto equipo de bombeo planta pilotoFoto equipo de bombeo planta pilotoFoto equipo de bombeo planta piloto Foto equipo de bombeo planta piloto
Una vez construida y probada la planta piloto, la puesta en marcha se llevó a cabo utilizando como influente agua decantada de la EDAR Quart-Benàger y llenando el reactor biológico con licor mezcla de dicha EDAR. Posteriormente se cambió el agua influente de la planta piloto por un agua residual sintética para evitar problemas de choques de carga, inhibiciones y, para tener una entrada de agua homogénea.
En un principio la aireación se mantuvo continua sin ninguna consigna de oxígeno, para favorecer el crecimiento de las bacterias autótrofas. Para ir adaptando el fango activo a la aireación intermitente se introdujeron paulatinamente los ciclos de marcha y paro. Comenzando por 15 min/15 min, hasta llegar progresivamente al ciclo de oxigenación intermitente elegido para este estudio que fue de 15 min marcha/75 min paro.
Uno de los problemas observados durante la puesta en marcha de la planta piloto fue el levantamiento y estancamiento del fango en el decantador secundario. La planta piloto operaba con aireación continua, por lo que en el reactor se llevaba cabo la nitrificación y el licor mezcla rico en nitratos llegaba al decantador secundario, en este, tenía lugar el proceso de desnitrificación causando el levantamiento del fango. Además el decantador secundario es estático y tiene un deflector para el paso del efluente produciendo un estancamiento del fango. Este problema se solucionó con la implantación de los ciclos de marcha y paro, que redujeron la concentración de nitratos considerablemente, con lo que se evitaron problemas de levantamiento del fango por desnitrificación en el decantador secundario.
3.3
3.3
3.3
3.3---- Condiciones de operaciónCondiciones de operaciónCondiciones de operaciónCondiciones de operación
En el transcurso de la puesta en marcha de la planta piloto, se fijaron los parámetros con los que se iba a trabajar a lo largo del estudio.
La temperatura de la planta se mantuvo en 25ºC, gracias a la climatización del laboratorio. El caudal de entrada se fijó en 20 l/d con agua residual sintética (cuya composición se muestra en la Tabla 6), con lo que el tiempo de retención hidráulico (TRH) es:
TRH = Volumen reactor / Caudal entrada = 18 l / 20 l/d = 0,9 d-1
Al disponer de un único reactor biológico, como sucede en muchas plantas de tratamiento, resulta potencialmente interesante la implantación de ciclos de aireación intermitente con el objetivo de poder llevar a cabo la eliminación de nitrógeno mediante el sistema nitrificación/desnitrificación. Para ello el reactor biológico aerobio tiene que trabajar con ciclos de aireación intermitente convirtiéndose en los ciclos de parada en un reactor anóxico.
La aireación intermitente se reguló por tiempo con ciclos alternados de 15 minutos de aireación y 75 minutos de paro. Además durante el periodo de marcha se dispone de agitación mediante pala mecánica a una velocidad de 20 giros/minuto. Durante el periodo anóxico se detuvo la agitación simulando el funcionamiento de una planta industrial durante la parada de las soplantes.
El tiempo de retención (TRC) se fijó en 18 días, por lo que el tiempo de retención aerobio (TRCaerobio) con el que se ha operado es de 3 días. Para mantener
este TRC se purgaba diariamente 1l de licor mezcla del reactor.
TRCaerobio = 15 min/90 min * 18 d = 3 días
Junto a este tiempo de retención celular tan bajo, se llevó a cabo el control de oxígeno con una consigna de 1 ppm comandada por el controlador SC200 para conseguir unas condiciones de trabajo límites para llevar a cabo la eliminación biológica de nitrógeno y que permitan a su vez un significante ahorro energético. Además mediante estas condiciones límite se pretendía estudiar la posibilidad de llevar a cabo la eliminación biológica de nitrógeno vía nitrito, dando lugar a un lavado de las bacterias nitritoxidantes.
Por último se muestra un cuadro resumen con las condiciones de operación de la planta piloto (Tabla 8).
Tabla Tabla Tabla
Tabla 8888---- Condiciones de operación de la planta pilotoCondiciones de operación de la planta pilotoCondiciones de operación de la planta piloto Condiciones de operación de la planta piloto
PARÁMETROS OPERACIONALES PARÁMETROS OPERACIONALESPARÁMETROS OPERACIONALES
PARÁMETROS OPERACIONALES Valores y UnidadesValores y UnidadesValores y UnidadesValores y Unidades
Q entrada 20 l/d Q salida 20 l/d Q recirculación 64 l/d Temperatura 25 ºC TRH 0,9 d-1 TRC ≈ 18 días Q purga ≈ 1 l/d Consigna de oxígeno 1 ± 0,2 mg/l
Ciclos de aireación y agitación mecánica 15 min marcha / 75min paro
3.4
3.4
3.4
3.4---- Fases del estudioFases del estudioFases del estudioFases del estudio
− Fase de crecimiento de la biomasa autótrofaFase de crecimiento de la biomasa autótrofaFase de crecimiento de la biomasa autótrofaFase de crecimiento de la biomasa autótrofa
En el inicio de la puesta en marcha de la planta piloto la aireación se mantuvo continua sin ninguna consigna de oxígeno, para favorecer el crecimiento de las bacterias autótrofas.
− Fase de adaptación a la aireación intermitenteFase de adaptación a la aireación intermitenteFase de adaptación a la aireación intermitenteFase de adaptación a la aireación intermitente
Para ir adaptando el licor mezcla a la aireación intermitente se introdujeron paulatinamente los ciclos de marcha y paro, así como la consigna de oxígeno. Comenzando por 15 min/15min, hasta llegar progresivamente al ciclo de oxigenación intermitente utilizado durante este estudio que fue de 15min marcha/75 min paro, ya que después de probar varias combinaciones de intermitencia, estas condiciones de trabajo permitían llevar a cabo simultáneamente la eliminación biológica de nitrógeno en valores admisibles, y un significante ahorro energético.
Para esta fase fue importante el control y monitorización del pH y oxígeno mediante las sondas presentes en el reactor, así como los resultados analíticos obtenidos para elegir correctamente el ciclo de intermitencia ideal.
− Fase de desarrollo del estudio: Aireación IntermitenteFase de desarrollo del estudio: Aireación IntermitenteFase de desarrollo del estudio: Aireación IntermitenteFase de desarrollo del estudio: Aireación Intermitente
Durante esta fase se realizan ensayos físico-químicos (DQO, NH4+, NO3-, NO2-, NT, PO43-, PT, SS, SSV) para obtener resultados del estado de eliminación biológica de nitrógeno, fosfóro y materia orgánica, y conocer si el sistema se encuentra en buenas condiciones.
A su vez se identifican y cuantifican las bacterias amonioxidantes (AOB) y nitritoxidantes (NOB) mediante técnicas microscópicas moleculares, para ver si existe una población nitrificante en el sistema que permita llevar a cabo la eliminación biólogica de nitrógeno.
Se realizan observaciones microscópicas del licor mezcla para realizar una bioindicación del fango activo y tinciones simples para la identificación de organismos acumuladores de polifosfatos.
Se determinan parámetros cinéticos de la biomasa autótrofa y heterótrofa, para ver el estado de la biomasa mediante ensayos respirométricos.
Durante esta fase también tiene lugar la simulación de la planta piloto, ajustando los parámetros cinéticos para reproducir los resultados experimentales obtenidos.
− Fase de análisis Fase de análisis Fase de análisis Fase de análisis de datosde datosde datosde datos
Esta fase está presente durante las tres fases anteriores del proyecto, para ir adaptando y analizando los resultados del proceso. Finalmente se estudian todos los resultados obtenidos y simulados, con el objetivo de obtener las conclusiones pertinentes.
3.5
3.5
3.5
3.5---- Método de identificación y cuantificación de las poblaciones Método de identificación y cuantificación de las poblaciones Método de identificación y cuantificación de las poblaciones Método de identificación y cuantificación de las poblaciones
bacterianas
bacterianas
bacterianas
bacterianas
3.5.1 3.5.13.5.13.5.1---- Condiciones de hibridaciónCondiciones de hibridaciónCondiciones de hibridaciónCondiciones de hibridación
Las condiciones de hibridación son un factor muy importante a tener en cuenta a la hora de realizar la hibridación. El efecto de la temperatura, así como el medio iónico en el que se encuentra el ADN o el ARN, permite la separación de las cadenas o regiones bicatenarias, en el caso del ADN, o en una sola cadena monocatenaria en el caso del ARN.
Las condiciones de fusión y la renaturalización de los ácidos nucleicos se ven influenciadas básicamente por cuatro factores:
- Temperatura: En condiciones normales, la temperatura de fusión del ADN es bastante alta, superior a 70 ºC, dependiendo de la secuencia primaria del ADN. Sin embargo, la técnica FISH requiere temperaturas de hibridación menores para evitar el estrés térmico y mantener así la integridad de las células.
- pH: Para realizar las pruebas de hibridación se suele emplear un pH próximo a la neutralidad, sin embargo se puede utilizar un pH elevado para obtener condiciones de elevada restricción. Este último término se refiere a la homología que existe entre el oligonucleótido o sonda que se utiliza en la técnica FISH y la secuencia de ARN a la cual va dirigida esa sonda. Cuanto mayor sea el grado de restricción mayor será la homología entre la sonda y la secuencia “diana”, y por lo tanto mayor grado de unión entre el híbrido ADN-ARN.
- Concentración de los cationes del medio: Estos cationes interactúan electrostáticamente con los ácidos nucleicos, de forma que cuanta más alta es la concentración, más estable es el híbrido. En la técnica FISH se utiliza el EDTA para complejar los cationes divalentes como el Ca2+.
- Presencia de solventes orgánicos: La desnaturalización de los ácidos nucleicos se produce entre los 80 y los 100 ºC. A esta temperatura de hibridación las muestras biológicas se deteriorarían. Los disolventes orgánicos reducen la estabilidad térmica de los ácidos nucleicos de doble cadena, pudiéndose llevar a cabo la hibridación a temperaturas más bajas. Normalmente se emplea formamida.
3.5.2 3.5.23.5.2
3.5.2---- Hibridación de las muestrasHibridación de las muestrasHibridación de las muestrasHibridación de las muestras
Los pasos a seguir son los siguientes:
- Aplicación de las muestras a los portaobjetos FISH
1- Poner un volumen de 3 μl de muestra fijada en el portaobjetos. 2- Secar al aire.
3- Deshidratar en EtOH al 50% durante 3min (por inmersión). 4- Deshidratar en EtOH al 80% durante 3min (por inmersión). 5- Deshidratar en EtOH al 98% durante 3min (por inmersión).
- Hibridación in situ
1- Preparar la solución de hibridación con formamida (Tabla 9) en un eppendorf de 2ml.
2- De la solución de hibridación con formamida, reservar en un eppendorf 6 x (10−n) μl, siendo n el volumen de sonda utilizada en cada pocillo.
3- Añadir al eppendorf reservado 6 μl de sonda (6 pocillos por porta = 6 μl de sonda) 4- Poner un trozo de papel de celulosa dentro de un tubo Sarstedt de 50ml y echar sobre el papel la solución de hibridación sin sonda.
5- Poner 9 μl de la solución de hibridación más 1 μl de sonda en cada pocillo y repartir homogéneamente por todo el campo.
6- Introducir el porta dentro del tubo Sarstedt, manteniendo siempre la posición horizontal.
7- Incubar a 46 ºC durante hora y media.
8- Preparar 50 ml de la solución de lavado (Tabla 10), y atemperar a 48 ºC.
9- Sacar del horno y rápidamente lavar los portas e introducirlos dentro del tubo con la solución de lavado.
10- Incubar en un baño a 48 ºC durante 15 − 20min. 11- Lavar con agua destilada.
12- Secar al aire en la oscuridad.
13- Si no se observa al microscopio inmediatamente, guardar el porta a −20 ºC dentro de un tubo Sarstedt de 50 ml.
Tabla Tabla Tabla
Tabla 9999---- Volúmenes de reactivos en función del porcentajeVolúmenes de reactivos en función del porcentajeVolúmenes de reactivos en función del porcentajeVolúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparacióde formamida para la preparacióde formamida para la preparación de lade formamida para la preparación de lan de la n de la solución tampón de hibridación en la té
solución tampón de hibridación en la té solución tampón de hibridación en la té
solución tampón de hibridación en la técnica FISHcnica FISHcnica FISHcnica FISH
Tabla Tabla Tabla
Tabla 101010---- Volúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparación de la10 Volúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparación de laVolúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparación de laVolúmenes de reactivos en función del porcentaje de formamida para la preparación de la solución tampón de lavado en la técnica FISH
solución tampón de lavado en la técnica FISH solución tampón de lavado en la técnica FISH solución tampón de lavado en la técnica FISH
Las sondas utilizadas en este trabajo son las que se muestran en la Tabla 11, donde se incluye el nombre de la sonda, la secuencia de nucleótidos y la referencia donde ha sido descrita la sonda.
Tabla Tabla Tabla
Tabla 11111111---- Sondas FISH de bacterias nitrificantes utilizadas para la identificación y cuantificaciónSondas FISH de bacterias nitrificantes utilizadas para la identificación y cuantificaciónSondas FISH de bacterias nitrificantes utilizadas para la identificación y cuantificación Sondas FISH de bacterias nitrificantes utilizadas para la identificación y cuantificación
Sonda
Sonda
Sonda
Sonda
Secuencia (5´Secuencia (5´----3Secuencia (5´Secuencia (5´
333´)´) ´)´)
EspecificidadEspecificidad EspecificidadEspecificidad
ReferenciaReferenciaReferenciaReferencia
Sondas utilizadas para identificar phyllum y clases del Dominio Sondas utilizadas para identificar phyllum y clases del Dominio Sondas utilizadas para identificar phyllum y clases del Dominio
Sondas utilizadas para identificar phyllum y clases del Dominio BacteriaBacteriaBacteriaBacteria
EUB 338 I GCTGCCTCCCGTAGGAGT Bacteria Amann (1990)
EUB 338 II GCAGCCACCCGTAGGTGT Planctomycetes Daims et al. (1999)
EUB 338 III GCTGCCACCCGTAGGTGT Verrumicrobiales Daims et al. (1999)
Sondas utilizadas para identificar subclases de la clase Sondas utilizadas para identificar subclases de la clase Sondas utilizadas para identificar subclases de la clase
Sondas utilizadas para identificar subclases de la clase ProteobacteriaProteobacteriaProteobacteriaProteobacteria
NSO1225 (*) CGCCATTGTATTACGTGTGA β-Proteobacteria Alonso et al (2009)
Sondas utilizadas para identificar géneros de Sondas utilizadas para identificar géneros de Sondas utilizadas para identificar géneros de
Sondas utilizadas para identificar géneros de