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Es muy importante notar que otras bacterias dependientes de NAD, incluyendo los

llegar a ser aislados a partir de tejidos de porcinos (principalmente pulmones) y pueden llegar a ser identificados erróneamente como Haemophilus parasuis (Oliveira, 2007). Por este motivo, es esencial realizar a cualquier aislamiento presumible de H. parasuis una serie de pruebas bioquímicas para diferenciarlo de otros microorganismos NAD dependientes.

Bioquímicamente H. parasuis se caracteriza por una actividad metabólica discreta, sin embargo, en mi experiencia las pruebas que más facilitan la diferenciación entre microorganismos semejantes son la presencia de las enzimas catalasa, la ureasa y el índol, como se detalla en la Tabla 3.

• Prueba de la Catalasa:

La catalasa es una enzima que descompone al Peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, esta enzima es similar a la estructura de la Hemoglobina. Excluyendo al género

Streptococcus y algunos otros la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias

facultativas tienen Catalasa. La base de esta prueba es demostrar la presencia de la enzima Catalasa, colocando 2 o 3 gotas al cultivo. El resultado es positivo si en la colonia hay efervescencia.

Ejemplos:

- Catalasa (+): Staphylococcus aureus, Haemophilus parasuis, Escherichia colli, Pseudomonas.

- Catalasa (-): Streptococcus spp. • Prueba de la Oxidasa:

Básicamente es la detección de la enzima Oxidasa, muy útil en la identificación de bacterias Gram (-). La reacción de la oxidasa se debe a la presencia del sistema de

citocromó oxidasa, la cual activa citocromós reducidos por oxígeno molecular, el cual transfiere un aceptor de electrones en el estado terminal del sistema de transferencia de electrones. El sistema de citocromós está generalmente presente en organismos aeróbicos. Un resultado positivo a la oxidasa consiste en una serie de reacciones en las cuales un componente auto-oxidable del sistema de citocromo es al final catalizado.

Utilizado Tetrametil-p-phenylendiamina al 1% hacia un cultivo bacteriano en un de papel filtro y un tubo capilar, obtenemos las siguientes reacciones, una reacción positiva se indica por la apariencia de un color púrpura oscuro en el papel en menos de 10 segundos, al contrario de la reacción negativa, que consiste en una ausencia de color púrpura.

Ejemplos:

- Oxidasa (+): Pasteurella multocida, Haemophilus parasuis. - Oxidasa (-): Escherichia coli

Este microorganismo tiene la capacidad de reducir los nitratos a nitritos, pero no es capaz de producir indol a partir de triptófano, ni descarboxilar la ornitina, la lisina o la arginina.

Es hábil en producir ácido de diversos sustratos como la glucosa, la manosa, la maltosa y la sacarosa; pero es incapaz de tomar como fuente de carbono a la xilosa, la lactosa, el manitol, la rafinosa, la melobiosa, la arabinosa. En el caso del inositol se obtiene un resultado variable según la cepa de estudio, igual que ocurre con la producción de SH². Igualmente H. parasuis no es apto en la producción de hemólisis y es negativo para la prueba de CAMP (Oliveira, 2007).

• Ácido de la Glucosa:

La mayoría de las bacterias de interés médico usan la glucosa como fuente de carbono, como parte importante de su metabolismo. Se determina si la bacteria usa la glucosa produciendo ácido y/o gas a partir de dicho carbohidrato. En un tubo con agua peptonada al 1% tapado, y un tubo de Durham, se inocula la bacteria por agitación teniendo cuidado de no mover el tubo de Durham e incubándolo 24 horas y 37°C se obtienen los siguientes resultados. Si la bacteria usa la glucosa producirá ácido y/o gas, por lo tanto el agua peptonada se observará rosa, si produce gas, se observará una burbuja en el tubo de Durham.

Ejemplos:

- Ácido y gas a partir de la glucosa: Escherichia coli, H. parasuis. - Negativo a producción de gas: Proteus stuartii.

Tabla 3. Pruebas bioquímicas especificas para la identificación de Haemophilus parasuis. Fuente: Oliveira, (2007).

Determinación Resultado Determinación Resultado

Necesidad de NAD + Ácido de arabinosa -

Hemólisis - Ácido de melobiosa -

Ureasa - Ácido de Trealosa -

Oxidasa + Ácido de celobiosa -

Catalasa + Ácido de rafinosa -

ONPG + Ácido de lactosa -

Fucosidadasa + Ácido de manitol -

Producción de indol - Ácido de la glucosa +

Crecimiento en agar MacConkey

- Ácido de la manosa +

Reducción de Nitratos + Ácido de la Maltosa +

Prueba de CAMP - Ácido de la sacarosa +

Inositol +/- Ácido de la Xilosa -

Bilis Esculina - Producción de SH². +/-

La diferenciación con otros microorganismos próximos puede llevarse a cabo mediante procedimientos de cultivo convencionales e incluso mediante la utilización de procedimientos rápidos en micro celdillas complementados con la información proveniente de los medios con sangre (hemólisis y CAMP). A este respecto, es conveniente la diferenciación de A. minor, A. indolicus, A. porcinus y Haemophilus

taxón C que, no siendo patógenos, comparten los mismos lugares de aislamiento

En lo posible, el aislamiento debe ir seguido de la tipificación serológica mediante la técnica de inmunodifusión en gel, normalizada, empleando una preparación calentada del antígeno. Debe recordarse, al respecto, que la prueba disponible, dista mucho de ser un procedimiento óptimo de clasificación, a la vista del gran porcentaje de cepas no tipificables, descritas por cualquiera de los autores que han referido resultados de tipificación en todos los países.

Las mínimas pruebas bioquímicas, requeridas para la diferenciación de H. parasuis con otros Actinobacillus pertenecientes a la familia Pasteurellaceae, se describe en la Tabla 4. En la cual se indicó con un paréntesis, las cepas que presentaron la misma homología en su ADN, de acuerdo con la hibridización de ADN-ADN. También se observan las características fenotípicas de las cepas referenciadas en estudios anteriores por Møller y col, 1990, 1996; Kielstein y col, 2001. Oliveira y col, 2004a y Oliveira, 2007a.

Tabla 4. Pruebas bioquímicas* mínimas necesarias para la diferenciación de H. parasuis de otros miembros de la familia Pasteurellaceae NAD-dependientes,

aislados a partir del tracto respiratorio en porcino. Fuente: Møller y col, 1990, 1996; Kielstein, y col. 2001; Oliveira, 2007.

Bioquímica Actinobacillus pleuropnemoniaea Actinobacilus minorb Actinobacillus porcinus b Actinobacillus indolicusb Haemophilus parasuisa Dependencia factor V + + + + + Hemólisis + - - - - CAMP + - - - - Ureasa + + - - - Indol - - - + - Catalasa - - - + + ONPG + + + + + Descarboxilación lisina - - - - - Descarboxilación ornitina - - - - - Formación de Ácido Glucosa + + + + + Galactosa + + + (d) + + Manosa + + + + + Fructosa + + - (d) + + Ramnosa - - (d) - - (d) - L-arabinosa - - - (d) - - Xylosa + -c _{+ (d)} c _{- (d) -} Sucrosa + + + + + Lactosa - + + - - Trealosa - d d - (d) - Maltosa + + +(d) + + Manitol + - + - - Sorbitol - - +(d) - - Dulcitol - - - - - Inositol - - +(d) - - Rafinosa - + +(d) + - Salicina - - - - - Esculina - - - - -

* Las reacciones son definidas como positivas (+) o negativas (-).

a. _{Según Møller y col. (1990).} b. _{Según Møller y col. (1996).} c. _{Cepa positiva de} A.

minor probada como negativa (Kielstein y col, 2001) en la fermentación de la xilosa.

Otras bacterias NAD-dependientes, no-hemolíticas y ureasa negativa han sido aisladas del tracto respiratorio superior de porcino. Estos aislamientos fueron descritos por primera vez como taxones C, D, E y F y solo podían ser diferenciados

de H. parasuis luego de extensas pruebas bioquímicas (Tabla 4). Los taxones D, E y

F se han encontrado como parte de la flora normal en el tracto respiratorio superior (Møller y col, 1990), pero también han sido aislados a partir de tejido de pulmón (Rapp-Gabrielson, 1992; Blackall y col, 1994). Sin embargo, en porcinos gnotobióticos1 infectados nasalmente con los taxones D y F, únicamente resulto en una colonización de las amígdalas, a excepción de un cerdo que mostró ataxia media y en donde el taxón D, pudo ser aislado nuevamente del cerebro (Chiers y col, 2001; Kielstein y col, 2001).

En algunos lugares se practica un método de fijación del complemento para la tipificación, pero plantea el grave inconveniente de numerosas reacciones cruzadas entre serotipos, lo que unido a la posibilidad de que en la misma explotación y aún en el mismo animal circulen distintos serotipos, representa un procedimiento muy complicado de usar y extraer conclusiones prácticas útiles.

La detección directa del antígeno puede intentarse mediante métodos inmunohistoquímicos, por ejemplo, un sistema avidina-biotina, como se ha demostrado en el caso del serotipo 5, en condiciones experimentales, aunque los resultados dependerán estrictamente de la calidad de los anticuerpos utilizados (policlonales o monoclonales). Tiene la ventaja de que pueden aplicarse a tejidos fijados en formol e incluidos en parafina, pero no resuelve reacciones falsamente positivas con A. pleuropneumoniae.

1 _{Animales con una microbiota conocida, que se han obtenido a partir de animales libres de}