2.3 Using the clock synchronization services
2.3.1 Synchronization time points (interval)
Los errores tienen casi siempre un carácter sagrado. Nunca intentéis corregirlos. Al contrario: lo que procede es racionalizarlos, compenetrarse con aquellos integralmente. Después, os será posible subliminarlos.
SALVADOR DALÍ
Los organismos estan compuestos por una amplia variedad de proteínas que aunque difieren en la secuencia de sus aminoácidos, y en el plegamiento 3-D de la cadena de aminoácidos, comparten una serie de propiedades ya que se componen esencialmente de los mismos aminácidos. Es así que varias proteínas que se encuentran en un mismo organismo pueden compartir algunas propiedades como por ejemplo su tamaño o su carga. En consecuencia cuando se busca purificar alguna proteína se deben realizar una serie de pasos secuenciales (marcha de purificación) en los que se van discriminando diferencias que en muchos casos resultan ser sutilies. El diseño de una estrategia purificación de proteínas es algo así como la búsqueda de una ruta que debe transitarse en tramos eliminando lo innecesario hasta alcanzar el objetivo con solo lo necesario. Diferentes rutas y diferentes tramos de rutas pueden ser exploradas y para continuar, cada tramo andado debe ser analizado adecuadamente de forma de tomar decisiones sobre si retroceder o seguir y en caso de seguir se debe analizar cuál sería el mejor tramo para continuar el camino. La elección de tramos se debe realizar en base a consideraciones sobre cómo evitar pérdidas de lo necesario, favorecer al máximo la eliminación de lo innecesario y también los costos y tiempo. Así en cado paso de purificación se debe evaluar no solo el rendimiento en la purificación de la proteína problema sino también la pureza alcanzada de la misma. Si bien no hay una sola secuencia de técnicas a seguir, en general se recomienda empezar por técnicas de alta capacidad y seguir con las de baja capacidad pero mayor especificidad. La estrategia a emplear deberá diseñarse teniendo en cuenta la cantidad y el grado de pureza que se quiera alcanzar según el uso que se dará a la proteína. Para usos en investigación, la escala es en general reducida y es mas importante la pureza que el rendimiento. Para usos terapéuticos la escala es mayor y la pureza requerida es máxima. Para usos industriales, frecuentemente se requiere gran cantidad, bajo
costo y menor pureza. Si el interés está en la proteína y no importa el organismo de donde se la extraerá, conviene buscar una fuente fácil de obtener, que contenga esa proteína en abundancia y de ser posible de bajo costo. Lo óptimo sería producir la proteína por métodos de ADN recombinante. Dependiendo también de la finalidad, la proteína que se quiere purificar deberá ser obtenida en conformaciones nativas o desnaturalizadas. Por ejemplo para evaluar actividad biológica la proteína debe tener una estructura funcional, en cambio para determinar la estructura primaria, la proteína puede estar desnaturalizada.
En este capítulo se presenta una descripción que incluye los aspectos más sobresalientes de las técnicas más utilizadas en el aislamiento, purificación y caracterización de enzimas.
Antes de introducirnos en las técnicas es importante tener en cuenta que es imposible diseñar y o realizar una estrategia de purificación de una proteína si no contamos con un método cuali y cuantitativo específico de la proteína en cuestión. Debemos contar con metodologías que nos permitan analizar luego de cada etapa de purificación si la proteína problema está, cómo está y de estar determinar en qué cantidad está. En el caso de enzimas, mientras que la determinación de las unidades enzimáticas totales (Actividad enzimática) resulta esencial para evaluar el rendimiento de su purificación, las medidas de la actividad específica (AE, relación entre la cantidad de proteína que se purifica sobre la cantidad de proteína total nos indica el grado de purificación alcanzado. El redimiento y el grado de purificación pueden evaluarse en forma global comparando los valores de actividad total y actividad específica hallados en la etapa final de la marcha de purificación respecto de los obtenidos en la etapa inicial de la purificación pero también puede evaluarse en cada nueva etapa respecto de la etapa anterior. En el primer caso estariamos evaluando el proceso global de la marcha de purificación y en el segundo estas determinaciones nos hablarán de la eficiencia de una etapa de purificación en particular. A continuación se presenta una tabla de purificación y los cálculos que nos permitirían evaluar la marcha de purificación realizada.
Tabla 9.1: Ejemplo de una marcha de purificación
Paso de Purificación
Actividad Total (Unidades enzimáticas totales; UET)
Actividad Específica (UET /mg de priteína total)
1 UETpaso 1 UETpaso 1/mg proteína totalpaso 1
2 UETpaso 2 UETpaso 2/mg proteína totalpaso 2
3 UETpaso 3 UETpaso 3/mg proteína totalpaso 3
Rendimiento Global= UETpaso 3/ UETpaso 1 x 100
Rendimiento Paso 2 respecto del paso 1= UETpaso 2/ UETpaso 1 x 100 Rendimiento Paso 3 respecto del paso 2= UETpaso 3/ UETpaso 2 x 100 Grado de purificación Global= Actividad específica del paso 3 Actividad específica del paso 1
Grado de purificación alcanzado en el paso 2= Actividad específica del paso 2 Actividad específica del paso 1
Grado de purificación alcanzado en el paso 3 respecto de la del 2 = Actividad específica del paso 3 Actividad específica del paso 2
Por otra parte, la calidad de muestra purificada se evalua generalmente a través de corridas electroforéticas en geles desnaturalizantes y en geles nativos los cuales pueden estar asociados o no a técnicas específicas de inmunblot. Estas técnicas son descriptas en este capítulo.