La tecnología de pirosecuenciación de última generación ha transformado drásticamente la forma de investigar el genoma, ya que en periodos acotados de tiempo (horas-días) es capaz de procesar una gran cantidad de información genómica, desde megabases (Mb) a gigabases (Gb), haciendo de esta plataforma una herramienta esencial en lo que respecta a nuevas tecnologías utilizadas en investigación científica (Cerdà y Manchado, 2013). En contraste con la secuenciación con el método Sanger, NGS es capaz de generar datos transcriptómicos masivos del genoma de forma rentable, gracias al continuo desarrollo y mejora de las tecnologías y metodologías, que han permitido reducir enormemente el costo de la secuenciación.
Diversas plataformas NGS difieren en cuanto a metodologías aplicadas, costos y cantidad de información procesada. Actualmente, se pueden dividir en dos grupos principales: plataformas de secuenciación de segunda generación y plataformas de tercera generación. Las plataformas de segunda generación requieren una etapa de amplificación de PCR previa a la reacción de secuenciación. Dentro de este grupo podemos encontrar las siguientes plataformas: (1) plataforma 454 (Roche Applied Science), basada en una PCR en emulsión seguida de la reacción de pirosecuenciación, es capaz de producir 0,4 a 0,5 Gb por lectura y alcanza una longitud media en sus secuencias de 400 a 700 pares de bases (pb); (2) plataforma Solexa Illumina® (Illumina, Inc.), basada en el fraccionamiento del genoma, seguido de una amplificación clonal sobre la superficie sólida de una celda de flujo. Esta plataforma es capaz de producir entre 200 a 300 Gb por lectura, con secuencias de 100 pb de longitud; y (3) Solid® (Life Technologies), basada en un proceso similar al
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utilizado en la plataforma 454 a excepción del anclaje final, el cual se realiza en una superficie de cristal donde se lleva a cabo la secuenciación (Glenn, 2011).
En relación a las tecnologías de tercera generación, éstas se basan en la secuenciación de una única molécula de DNA sin la necesidad de efectuar una amplificación mediante PCR. Las principales plataformas son PacBio (Pacific Biosciences of California, Inc.), GridION ((Oxford Nanopore Technologies Ltd.) y HeliScope (Helicos BioSciences Corporation) (Van Dijket al., 2014).
Secuenciación 454
Entre las diferentes plataformas NGS existentes, la 454 se ha convertido en un método factible para aumentar la profundidad y la cobertura de la secuenciación. Siguiendo el método de pirosecuenciación (Ronaghi et al., 1996), los niveles de error en esta plataforma son bajos (<1 %) debido a la presencia de homopolímeros, errores que generalmente son resueltos gracias a la profundidad y cobertura de la secuenciación mediante el ensamblado y superposición de lecturas. Como resultado, el uso de la plataforma 454 puede ser más preciso que las metodologías de secuenciación tradicionales, lo que la convierte en una poderosa herramienta para la interpretación de elementos funcionales en el genoma y que ha comenzado a promover y facilitar los estudios transcriptómicos en peces (Qianet al., 2014).
Para llevar a cabo la secuenciación mediante esta tecnología, el DNA debe ser aislado y posteriormente fragmentado. Los fragmentos son adheridos a adaptadores específicos unidos a microesferas de agarosa (cada fragmento de DNA está asociado a una microesfera) que se encuentra dentro de una solución de agua y aceite formando burbujas. De esta manera, se logra la separación entre cada una de las microesferas. Cada burbuja formada con la microesfera en su interior es un microrreactor que contiene los reactivos y enzimas necesarias para poder realizar la PCR (PCR en emulsión) y así obtener un gran número de copias del fragmento de DNA en la superficie de la microesfera (aproximadamente un millón de copias) (Margulieset al., 2005).
La siguiente etapa consiste en cargar las microesferas en una placa “PicoTiterPlate” que será introducida en el equipo secuenciador. La placa cuenta con un millón de pocillos, con lo cual en cada pocillo queda una esfera con sus respectivos fragmentos de DNA. Finalmente, mediante la utilización de enzimas, tales como la sulfirasa y la luciferasa se produce la emisión de luz debido a la incorporación de nucleótidos en la cadena de DNA. La luz es captada e interpretada mediante programas bioinformáticos, identificando qué tipo de base nitrogenada se ha incorporado (Figura 10).
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Figura 10. Flujo de trabajo de amplificación de PCR en emulsión. (a) DNA genómico es aislado, fragmentado y ligado a adpatadores. (b) Los fragmentos son unidos a microesferas en las cuales se produce la amplificación en presencia de reactivos y enzimas necesarias para la reacción. (C) Las microesferas son dispuestas en la placa “PicoTiterPlate” donde se produce la reacción de pirosecuenciación. Figura adaptada de Mardis (2008).
1.9 MICROARRAYSDE EXPRESIÓN GÉNICA
Las técnicas genómicas de alto rendimiento desarrolladas en los últimos años han automatizado técnicas experimentales de biología molecular convencional con el fin de realizar los análisis y obtener datos a gran escala. En el área de transcriptómica, los microarrays de oligonucleótidos para determinar los perfiles de expresión génica han protagonizado una revolución
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en el campo biológico debido principalmente a la capacidad que presentan para abordar el estudio simultáneo de la expresión de miles de genes a bajo costo económico.
Gracias a la aplicación de esta herramienta, la genómica funcional se presenta como una nueva área de la ciencia capaz de determinar los genes responsables de cambios fenotípicos, procesos biológicos, procesos moleculares, respuesta a enfermedades, etc. (Miller y Maclean, 2008). El uso de esta tecnología ha servido para estudiar la genómica funcional de diversas especies modelos como es el caso de Homo sapiens, Drosophila melanogaster, Saccharomyces cerevisiae, Mus musculus,
Xenopus laevis, Caenorhabditis elegansyDanio rerio(Altmannet al., 2001; Furlonget al., 2001; Jiang
et al., 2001; Loet al., 2003; Wanget al., 2004).
El funcionamiento del microarrayse basa en determinar el nivel de hibridación entre sondas de DNA unidas a una superficie sólida y la molécula diana (por ejemplo, por competición entre dos muestras, cada una de ellas marcadas con un fluorocromo diferentes, generalmente cianina de coloración verde -Cy3- y roja -Cy5-). Existen dos tipos principales demicroarraysde expresión génica en función del tipo de sonda utilizada para detectar la expresión:Microarraysde cDNA yMicroarrays
de oligonucleótidos. Los de cDNA presentan sondas de moléculas de DNA de entre 500 y 5000 pares de bases. En cambio, los de oligonucleótidos contienen secuencias de oligonucleótidos sintetizadasin situ mediante fotolitografía. Pionera en comercializar esta tecnología fue la compañia Affymetrix, utilizando sondas sintetizadas directamente en la superficie del microarray con una longitud de 25 pares de bases. Por otra parte, microarrays diseñados por la compañía Agilent (utilizados en este estudio) comprenden la síntesisin situde oligonucleótidos de 60 bases de longitud, lo cual se traduce en una ventaja comparativa mejorando la selectividad debido al aumento de la longitud de la sonda. En la práctica, esta ventaja se ve reflejada al observar mayor fluorescencia en el sitio de hibridación
(Šášik et al., 2004). Otra de las ventajas que presenta la metodología Agilent, es una herramienta
web (eArray) que permite a los usuarios personalizar el diseño de microarray. En función del experimento concreto a analizar se puede optar entre una u otra plataforma, considerando que cada una presenta sus propias ventajas y desventajas.