TABLE 11: SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF PSR AS A DIAGNOSTIC TOOL

La bibliografía reporta que miembros del cBc son capaces de sintetizar moléculas de C4-HSL a C10-HSL. Sin embargo, de acuerdo a nuestros conocimientos, nada ha sido reportado

en este sentido para aislados clínicos o ambientales de B. contaminans. Previamente demostramos que estos organismos pueden crecer adheridos a superficie y formar biofilm, la pregunta es si pueden producir moléculas del tipo de las AHL. A efectos de llevar a cabo estos análisis se comenzó a trabajar sobre la detección de estas moléculas en cajas de Petri empleando como cepas biosensoras a C. violaceum. Estos agentes fueron sembrados perpendicularmente a las cepas potencialmente productoras de AHLs en placas de Petri conteniendo medio sólido LB. Dichas placas se incubaron a 30°C registrando los resultados de crecimiento y de inducción de las cepas biosensoras a distintos tiempos. Las cepas productoras de AHLs empleadas como controles positivos en esta calibración fueron: B. cepacia ATCC 25416, P. aeruginosa PAO1 ATCC 27853 y S. marcescens AS-1. La formación del pigmento violaceína en los cultivos de C. violaceum actuó como indicador de la inducción de dichas cepas biosensoras por la acción de AHLs liberadas por las cepas productoras de estas moléculas. En la Figura 23 (A) y (B) se puede observar los resultados del crecimiento de las distintas cepas mencionadas y de la inducción de las cepas C. violaceum CV026 y VIR07 a las 18 h de incubación. Todas las cepas alcanzaron óptimos crecimientos en el medio sólido LB. La formación del pigmento violeta consiguió ser correctamente visualizada a partir de las 14 h de incubación tanto para CV026 como para VIR07. Asimismo, a través de las imágenes de la Figura

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24 se pudo comprobar que las cepas biosensoras de C. violaceum no poseen la capacidad de activar su propia inducción.

Figura 23. Calibración del ensayo de detección de AHLs en placas de Petri utilizando las cepas biosensoras C. violaceum CV026 y VIR07. (A) Las cepas C. violaceumCV026 y VIR07 fueron sembradas perpendicularmente a cepas productoras de AHLs en placas de Petri con medio sólido LB. Las placas se incubaron a 30°C registrando el crecimiento de todas las cepas y la inducción de las cepas biosensoras a las 18 h. (B) Placas de Petri conteniendo medio BHA suplementado con 2,5% (v v-1) de suero fetal bovino fueron utilizadas para sembrar B. pertussis Tohama I, B. cepacia y las cepas C. violaceum CV026 y VIR07. La formación de pigmento violeta es indicador de la inducción de las cepas biosensoras. CV026 y VIR07: Cepas biosensoras de C. violaceum. Bc: B. cepacia ATCC 25416, AS-1: S. marcescens AS-1, PAO1: P. aeruginosa PAO1. (Fotografía cedida gentilmente por El Dr. Diego G. Noseda, Año 2011).

Una vez estandarizada la metodología basada en el crecimiento de la población en medio sólido, se probaron extractos de sobrenadantes de cultivos líquidos de cepas productoras de AHLs. Se emplearon como controles positivos de la inducción las mismas cepas que habían resultado positivas en el ensayo anterior y los mismos agentes biosensores. Se utilizaron placas conteniendo medio LB semi-sólido las cuales fueron inoculadas con las cepas biosensoras de C. violaceum. La formación de halos de color violeta de C. violaceum fue indicador de la presencia de AHLs en los extractos testeados. Los extractos de medio de cultivo fueron obtenidos a partir de un desarrollo de B. cepacia ATCC 25416 en 100 ml de medio. El extractivo en diclorometano concentrado 250 veces, originó la inducción de ambas cepas de C. violaceum formando halos con diámetros de 1,8 cm y 2,4 cm para CV026 (Figura 24 A) y para el biosensor VIR07 (Figura 24 B) respectivamente, mientras que una dilución 1:50 del mismo extracto generó halos considerablemente más pequeños con los dos biosensores. Cabe mencionar que los resultados obtenidos a partir de este extracto constituyen un control positivo y aval de la metodología empleada en la extracción de la molécula señal del medio de

A Bc PAO1 AS-1 CV026 VIR07 B Bc CV026 VIR07 Tohama

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cultivo. Un extracto obtenido de 600 ml de medio de cultivo líquido sin inocular y concentrado 5000 veces, no activó la formación de halos de coloración por parte de la cepa CV026 como tampoco de VIR07, sugiriendo que dicho medio de cultivo no contiene moléculas con actividad inductora de estas cepas biosensoras (Figura 24 A y 24 B).

En vista de estos resultados se analizó la presencia de señales de AHL en extractos de cultivos líquidos y en sobrenadante de biofilm (formados en placa multipocillo) de 84 aislados de B. contaminans. Los extractos se obtuvieron a partir de 3 ml de medio de cultivo y se concentraron 30 veces. Dichos extractos fueron aplicados directamente en un volumen de 10

l sobre la superficie de los medios agarizados. Los resultados de actividad QS se resumen en la Tabla A.

Figura 25. Detección de moléculas de AHLs a partir de extractos de sobrenadante de desarrollo en

biofilm de 12 aislados clínicos de B. contaminans empleando las cepas biosensoras C. violaceum CV026 y VIR07. Extractos obtenidos a partir de cultivos líquidos y biofilm fueron aplicados directamente sobre medio LB semi-sólido inoculado con las cepas biosensoras C. violaceum CV026 (A) y C. violaceum VIR07 (B). La formación de halos de color violeta es indicador de la presencia de AHLs en los extractos de B. contaminans. 1 2 3 1 2 3

A B

Figura 24. Ensayo de detección de AHLs por difusión empleando las cepas biosensoras C. violaceum CV026 y VIR07. Extractos obtenidos a partir de cultivos líquidos fueron aplicados a discos de papel colocados sobre medio LB semi-sólido inoculado con las cepas biosensoras C. violaceum CV026 (A) y C. violaceum VIR07 (B). La formación de halos de color violeta es indicador de la presencia de AHLs en los extractos. 1: μl de e t a to

de B. cepacia 25416, concentrado 250 veces; 2: concentrado 50 veces; 3: μl de e t a to de l de

medio de cultivo sin inocular, concentrado 5000 veces.

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En la Figura 26, se observa el % de aislados positivos para la presencia de señales de QS (AHLs) según el origen del aislado. Al considerar solo los grupos de aislados denominados FQ- Crónicos y FQ-Iniciales, se observó una disminución en la expresión de señales de QS en los aislados FQ-Crónicos; mediante Chi-cuadrado de Pearson se verificó que esta diferencia era significativa (p< 0,05).

Figura 26. Detección de moleculas de QS en 84aislados de B. contaminans agrupados según origen de la muestra. Los valores corresponde al porcentaje en cada clase. E la atego ía FQ- ó i os la disminución de expresión de señales de QS sólo fue significativamente menor a la obtenida para la

atego ía FQ-I i iales p < . .