Technology Deployment

1.1. INTRODUCCIÓN

Véase la introducción general de la parte B (punto A). 1.2. DEFINICIÓN

Véase la introducción general de la parte B (punto C). 1.3. SUSTANCIAS DE REFERENCIA

Ninguna.

1.4. PRINCIPIO DEL MÉTODO

El ensayo citogenético in vitro es un ensayo de mutagenicidad a corto plazo destinado a descubrir aberraciones cromosómicas estructurales en células de mamíferos en cultivo. Pueden utilizarse cultivos de líneas celulares establecidas, así como cultivos de células primarias. Después de la exposición a las sustancias de ensayo en presencia y en ausencia de un sistema adecuado de activación metabólica, se tratan los cultivos celulares con un inhibidor mitótico, como la colchicina, con el fin de acumular las células en un estadio de la mitosis similar a la metafase (c-metafase). Las células se recolectan en el momento oportuno y se hacen preparaciones cromosómicas. Se tiñen estas preparaciones y se analizan las células en metafase para descubrir las aberraciones cromosómicas.

1.5. CRITERIOS DE CALIDAD Ninguno.

1.6. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO 1.6.1. Preparación

1.6.1.1. Células

Se utilizan líneas celulares establecidas o cultivos de células primarias, por ejemplo, células de hámster chino y linfocitos humanos. Las sustancias de ensayo se preparan en medio de cultivo o se disuelven en vehículos apropiados antes del tratamiento de las células.

1.6.1.2. Sistema de activación metabólica

Las células deben exponerse a la sustancia de ensayo tanto en presencia de un sistema adecuado de activación metabólica como sin este sistema. El sistema más comúnmente utilizado es una fracción postmitocondrial suplementada con cofactor, preparada a partir de hígado de roedores tratados con agentes inductores de enzimas.

1.6.2. Condiciones de ensayos Número de cultivos

Se utilizan al menos dos cultivos para cada ensayo. Utilización de testigos positivos y negativos

Se utilizan como testigos negativos el disolvente (cuando no sea el medio de cultivo o el agua), la mezcla de activación de enzimas hepáticas, la mezcla de activación de enzimas hepáticas con el disolvente y los testigos no tratados.

Se incluye un testigo positivo en cada experimento; cuando se utilice la mezcla de activación de enzimas hepáticas para activar la sustancia de ensayo, el testigo positivo deberá ser una sustancia que necesite una activación metabólica.

Dosis

Como mínimo se utilizan tres dosis de la sustancia de ensayo en un intervalo de al menos una unidad logarítmica; la dosis más elevada reducirá la actividad mitótica alrededor de un 50% o mostrará alguna indicación de citotoxicidad. Si no es tóxica, la sustancia de ensayo se probará hasta su límite de solubilidad o hasta una concentración máxima de 5 mg/ml.

Condiciones de cultivo

Se utiliza un medio de cultivo y condiciones de incubación apropiados (por ejemplo, temperatura, recipientes de cultivo, concentraciones de CO2 y humedad).

1.6.3. Procedimiento

1.6.3.1. Preparación de los cultivos

Líneas celulares establecidas: las células se obtienen a partir de cultivos madre (por ejemplo, por tripsinización o por agitación vigorosa), se siembran en recipientes de cultivo a la densidad adecuada y se incuban a 37 °C.

Linfocitos humanos: se añade sangre completa heparinizada a un medio de cultivo que contenga fitohemaglutinina, suero de feto de ternera y antibióticos, y se incuba a 37 °C.

1.6.3.2. Tratamiento de los cultivos con la sustancia de ensayo i) Tratamiento sin mezcla de activación de enzimas hepáticas

Todos los tratamientos deben cubrir, a ser posible, al menos el período de un ciclo celular completo y los sistemas de fijación deben garantizar el análisis de las primeras mitosis posteriores al tratamiento de las células tratadas en los distintos estadios del ciclo.

Cuando el tratamiento no cubre un ciclo celular completo, se escogen tiempos de fijación múltiples para extraer muestras de células que se encuentren en estadios diferentes del ciclo celular durante el tratamiento, es decir G1, S y G2.

La sustancia de ensayo se añade a los cultivos de líneas celulares establecidas cuando éstas estén en su fase de crecimiento exponencial. Los cultivos de linfocitos humanos se tratan cuando aún están en estado semisincrónico.

ii) Tratamiento con mezcla de activación de enzimas hepáticas

Para el tratamiento, la sustancia de ensayo en combinación con la mezcla de activación de enzimas hepáticas debe estar presente el mayor tiempo posible, aunque sin llegar a producir un efecto tóxico en las células. Si, por razones de toxicidad, el tratamiento no puede cubrir el período de un ciclo celular completo, se deben escoger tiempos de fijación múltiples para extraer muestra de células que se encuentren en diferentes estadios del ciclo celular en el momento del tratamiento, es decir G1, S y G2.

Recolección de las células

Los cultivos celulares se tratan con un inhibidor del huso mitótico antes de su recolección durante un período adecuado. Para la preparación de los cromosomas, cada cultivo se recolecta y trata por separado.

Se necesitan al menos dos momentos de recolección de células. Se recomienda que uno se haga aproximadamente al final de un ciclo celular y otro más tarde; ello permite abarcar con seguridad todos los estadios del ciclo celular y prevé los retrasos de éste.

1.6.3.3. Preparación de los cromosomas

La preparación de los cromosomas comprende un tratamiento hipotónico de las células, la fijación, la distribución en portaobjetos y la tinción.

Análisis

Para descubrir las aberraciones cromosómicas, de cada cultivo se analizan al menos 100 metafases bien distribuidas. Los portaobjetos se codifican antes del análisis. En los linfocitos humanos sólo se analizan las metafases que contengan 46 centrómeros.

En las líneas celulares establecidas, sólo se analizan las metafases con ±2 centrómetros del número modal.

Además debe valorarse durante el ensayo, para cada dosis, el índice mitótico o cualquier otra indicación de citotoxicidad, cuando proceda.

2. RESULTADOS

Los resultados se presentarán en forma de tabla. Se registrarán por separado las aberraciones de tipo cromatídico (lagunas, fracturas, intercambios), las aberraciones de tipo cromosómico (p. ej. lagunas, fracturas, cromosomas enanos, anillos, dicéntricos, policéntricos) y el número de metafases anormales (lagunas incluidas y excluidas), tanto de todos los cultivos tratados como de los cultivos testigo.

Los resultados se evaluarán con métodos estadísticos apropiados. Los resultados se compararán con testigos negativos concomitantes.

Se realizarán al menos dos ensayos independientes. Sin embargo, si hay justificación científica, puede bastar un ensayo único. No es necesario realizar el segundo de forma idéntica al ensayo inicial. De hecho, puede ser preferible alterar algunas condiciones del ensayo para obtener datos más útiles.

3. INFORME

3.1. INFORME DEL ENSAYO

El informe del ensayo incluirá, a ser posible, la siguiente información: –células utilizadas,

–condiciones del ensayo: composición del medio, concentración del CO2, temperatura de incubación, duración de la incubación, dosis, momento del tratamiento, duración del tratamiento con el inhibidor de huso mitótico y concentración de éste, tipo de mezcla de activación de enzimas hepáticas utilizada, testigos positivos y negativos,

–número de cultivos celulares,

–número de metafases analizadas (por separado para cada cultivo), –índice mitótico u otras indicaciones de citotoxicidad,

–tipo y número de aberraciones por separado para cada cultivo tratado y testigo, número modal de cromosomas en las líneas celulares establecidas utilizadas,

–evaluación estadística, –discusión de los resultados, –interpretación de los resultados.

3.2. EVALUACIÓN E INTERPRETACIÓN

Véase la introducción general de la parte B (punto D). 4. BIBLIOGRAFÍA

Véase la introducción general de la parte B (punto E).

B.11. ENSAYO CITOGENÉTICO IN VIVO EN MÉDULA OSEA DE MAMÍFEROS, ANÁLISIS CROMOSÓMICO