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Se presenta un cromatograma HPLC-UV de referencia de las muestras que se llevaron a analizar mediante HPLC con detección de MS/MS (Figura 4.2.5.1.). Se planteó el análisis de los tres picos identificados en el cromatograma. El pico que presenta tiempo de retención a los 16.9 minutos sería el correspondiente al BZN droga madre, los picos acompañantes antes y después del mismo, serían metabolitos a identificar.

En la Figura 4.2.5.2 se presentan cromatogramas de referencia comparativos de pacientes al comienzo del tratamiento (a) y (b) en estado estacionario del tratamiento. Se puede observar que en el cromatograma (b) existe más de un compuesto mayoritario en circulación, este tipo de cromatogramas fueron la evidencia de la existencia de metabolitos circulantes.

Figura 4.2.5.1. Cromatograma de referencia

0 5 10 15 20 25 30 35 time (min) B03/2 IV 14.9 16.9 19.9

Herramientas farmacométricas para antichagásicos PÁGINA | 107 Figura 4.2.5.2 Cromatogramas de referencia comparativos: (A) Muestras de plasma de

pacientes al inicio del tratamiento. (B) Muestras de plasma de pacientes en estado estacionario del tratamiento.

Observaciones mediante espectrometría de masas:

Todas las muestras analizadas mediante HPLC/MS/MS presentaron perfiles cromatográficos similares, con la presencia de dos picos, apareciendo el primer pico (pico A) a un tiempo de retención de 5,8 minutos y un pico de tardío (pico B) (Figura 4.2.5.3) con un tiempo de retención en 10,4 minutos.

Ambos picos no fueron simétricos y presentaban un pre-hombro. En el recuadro superior de la Figura 4.2.5.3 se muestra el cromatograma del espectro de masa en el rango de 50 a 900 m/z para el tiempo total de elución. Los picos no resueltos que eluyen entre el minuto 1 y 3 es material no retenido cromatográficamente, predominantemente sales y acetonitrilo. Los picos asociados con el BZN son los marcados como picos A y B.

Figura 4.2.5.3. Cromatograma representativo de espectro de masas de extractos en acetonitrilo de muestras de plasma en un rango de 100 a 300 m/z eluídos en tiempos entre 3 y 15 minutos.

El espectro de MS del pico A (Figura 4.2.5.4), está compuesto de un ion molecular principal [M +H]+ que aparece en un m/z de 261y una menor señal de un ion molecular [M+Na]+ que aparece en m/z de 283. El espectro de masa en tándem del ion molecular principal [M+H]+ (261 m/z), también mostrado en la Figura 4.2.5.4, consistió en cuatro fragmentos principales de m/z de 214, 148, 107 y 91 para todas las muestras analizadas.

El análisis de masas exactas del ion principal es compatible con la formula molecular C13H13N4O3, que corresponde al ion [BNZ+H]+, y el segundo ion es compatible con la formula molecular C12H12N4O3Na, que corresponde al ion [BNZ+ Na]+.

El espectro de MS del pico cromatográfico que presenta un tiempo de retención de 10,3 minutos se muestra en la Figura 4.2.5.5 (a). El espectro de masa en tándem del ion molecular principal [M + H]+ con m/z de 150 también se presenta en la Figura 4.2.5.5 (c), y es compatible con el análisis de masas exactas para la formula molecular de C9H12NO que puede ser asignado al compuesto N-bencilacetamida (NBAA). En el espectro en tándem de fragmentación de este ion principal se hallaron tres productos principales con m/z de 135, 120 y 107 para todas las muestras analizadas.

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Figura 4.2.5.4. (a) ESI-MS positivo para el pico A (BNZ) de extracto de plasma.

(b) Detalle del espectro de masas del ión molecular principal [M + H]+ en un m/z de 261. (c) Patrón de fragmentación MS en tándem del ion molecular principal para el pico A (BZN).

Figura 4.2.5.5. Perfil de fragmentación de N-BAA: (a) ESI-MS en modo positivo para el pico NBAA de extractos plasmáticos; (b) Detalle del espectro de masas del ion molecular principal [M+H]+ para m/z de 150; (c) Análisis del perfil MS en tándem para el ion molecular principal NBAA de extractos plasmáticos.

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Tabla 4.2.5.1. Estructuras propuestas para los m/z hallados del patrón de fragmentación del ión principal m/z 150 de la NBAA.

HN O N-Benzyl-acetamide [C9H11NO + H]+ Exact Mass: 150.09134 Mol. Wt.: 150.19713 m/e: 150.09189 (100.0%), 151.09524 (10.0%) C, 71.97; H, 8.05; N, 9.33; O, 10.65 HN O [C₈H₈NO+H]+ Exact Mass: 135.06787 Mol. Wt.: 135.16261 m/e: 135.06841 (100.0%), 136.07177 (8.9%) C, 71.09; H, 6.71; N, 10.36; O, 11.84 N-Benzyl-formamide N CH2 [C8H9N+H]+ Exact Mass: 120.08078 Mol. Wt.: 120.17115 m/e: 120.08132 (100.0%), 121.08468 (8.9%) C, 79.96; H, 8.39; N, 11.66 N-methylidene(phenyl)methanamminium NH2 [C7H8N+H]+ Exact Mass: 107.07295 Mol. Wt.: 107.15251 m/e: 107.07350 (100.0%), 108.07685 (7.8%) C, 78.46; H, 8.47; N, 13.07 Benzyl-ammonium

Esta serie de iones y sus m/z son compatibles con el análisis de masas exactas de fórmula molecular C8H9NO, C8H10N y C7H9N respectivamente. Estas estructuras corresponden a la N-bencil formamida, N-metilideno (fenil) metanamino y bencil amonio, todos estructuralmente relacionados con la NBAA. La asignación de estos fragmentos moleculares para el pico con m/z 150 se muestra en la Tabla 4.2.5.1.

4.2.5.1. SÍNTESIS Y CARACTERI ZACIÓN DE LA NBAA:

Se obtuvieron 200 mg de N-BAA impura y luego del proceso de recristalización se obtuvieron 165 mg de N-BAA pura. La pureza del producto de síntesis fue del 82,5 %, sin embargo el rendimiento de la reacción fue cercano al 30%.

Se halló el rango del punto de fusión de una muestra sintetizada y recristalizada, siendo este de 58-60°C. Según datos bibliográficos, la NBAA tiene un punto de fusión entorno a los 60- 61°C. Este sólido sintetizado se reservó como droga patrón para futuras búsquedas en nuevas muestras. La Figura 4.2.5.1.1 representa la reacción de síntesis.

Por otro lado, cromatográficamente se puede caracterizar a la NBAA como un compuesto que eluye después que su droga madre BZN, lo que según el método en fase reversa utilizado, respondería a un compuesto de características menos polares que las encontradas para BZN. Figura 4.2.5.1.1. NH₂ C H₃ O OCl NH O CH₃ Cl H

+

+

Bencilamina Cloruro de acetilo _{N-bencilacetamida}

ácido clorhídrico AE

Tabla 4.2.5.1.1. Cuadro comparativo de características cromatogríaficas y espectrométricas entre BZN y NBAA

BZN N-BAA

Tiempo retención HPLC-UV sistema seleccionado* 5,8 minutos 10,4 minutos m/z por HPLC-MS BZN(H)+ 261,09739 NBAA(H)+ 150,09224 +MS2 (m/z) 214,09062 148,07561 118,06260 107,04884 91,05377 135,07008 122,09596 120,08125 107,07365

*Sitema HPLC/UV:Columna Lichrocart 125-4, Lichrospher 100 mm RP-8 (5 µm, particula) Merck. FM: 75:25

(H2O: AcN) Flujo: 0,4 mL/min. Longitud de onda (λ) 220 nm.

Sistema HPLC MS/MS: Columna Phenomenex Luna C18 (3µm partícula) (100 x 2 mm), FM: 70%H2O (0,1 %

ácido formico):30%AcN, Flujo 0,2 mL/min. Detector de arreglo de diodos. Ionización ESI en modo positivo. Así mismo, se compararon los patrones de fragmentación halladas en nuestro estudio de MS/MS para la NBAA y BZN, con los encontrados mediante búsqueda

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bibliográfica para la NBAA. Validando la identidad del compuesto estudiado ya que los patrones de fragmentación fueron similares. Se presenta un resumen de las características cromatográficas más relevantes halladas para la N-BAA y el BZN, Tabla 4.2.5.1.1.