La expresión constitutiva de moléculas de MHCII está restringida a una subpoblación de células especializadas en la presentación de antígenos a los linfocitos T que se denominan células presentadoras de antígeno (APC). Estas células tienen desarrollados mecanismos muy efectivos para captar proteínas provenientes de patógenos exógenos, procesarlas y presentar en la superficie celular los péptidos generados unidos a las moléculas de MHCII. Sin embargo, en condiciones de autoinmunidad, las células epiteliales periféricas también pueden expresar moléculas de MHCII en su superficie (Catalfamo 1997). En las enfermedades autoinmunes órgano-específicas estas células epiteliales son el principal objetivo de la respuesta inmune evidenciándose que existe una relación entre los complejos péptido-MHCII formados y el inicio o la perpetuación de esta respuesta.
Las células epiteliales están especializadas en la síntesis y secreción de moléculas específicas del tejido en el que se encuentran (como pueden ser las hormonas en las células endocrinas) existiendo, por lo tanto, diferencias importantes en las vías endocítica y secretora de estas células respecto a las APC. Estas características, junto con la expresión de diferentes proteasas en cada tipo celular, condicionarán el repertorio peptídico capaz de unirse a la molécula de MHCII en cada célula.
En este capítulo se ha comparado el repertorio peptídico asociado a DR en una APC homocigota para el alelo HLA-DR4*0401 (células B-LCL) con el de una línea celular de insulinoma de rata (RIN) transfectada con el mismo alelo de DR y las moléculas Ii y HLA-DM (línea celular DR4IiDM). Esta línea transfectada expresa moléculas de clase II en superficie y se considera un modelo de célula epitelial autoinmune (Serradell 1999). En este trabajo se han evidenciando diferencias tanto en el tipo de péptidos presentados como en las características de las proteínas origen identificadas a partir de éstos.
Las líneas celulares fueron generadas en trabajos previos en el laboratorio de la Dra Jaraquemada (Serradell 1999). El nivel de expresión de las moléculas DR4, Ii y DM en estas células se determinó por inmunofluorescencia y citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-DR, Ii y DM y un anticuerpo anti-CLIP (CerCLIP) que es específico para todos los complejos de CLIP presentes en la superficie, incluyendo DR/, DP/ y DQ/CLIP. Los niveles de expresión en la línea DR4IiDM se compararon con los de la línea B-LCL de referencia. Estos análisis se realizaron cada 2 o 3 semanas durante el crecimiento de las células para comprobar que los niveles de expresión de las moléculas eran correctos y no existían problemas de desdiferenciación.
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Los niveles de CLIP detectados en la superficie de las células B-LCLs fueron bajos, no detectándose estos complejos en la superficie de las células DR4IiDM (Figura 41a). Este hecho puede ser el resultado de diferencias en los mecanismos de presentación o consecuencia de la contribución de otras moléculas como DP y DQ a la presentación de CLIP en el caso de las B- LCL (estas moléculas están ausentes en la célula epitelial transfectada).
Tabla XIV: Cuantificación de los niveles de expresión de las tres moléculas utilizando la intensidad media de fluorescencia detectada (MFI) (Muntasell 2002).
MFI DR4 Ii HLA-DM
B-LCL 425 97 22
DR4IiDM 325 77 35
La expresión de DR e Ii era mayor en las células B-LCL mientras que los niveles de HLA-DM eran superiores en las células DR4IiDM (Tabla XIV). La relación DR/DM era muy diferente entre estas células (9 frente a 19 en células epiteliales y B-LCL respectivamente) mientras que la relación DR/Ii no variaba(4 en ambos casos). Es interesante observar que las relaciones observadas para estas moléculas en nuestro modelo de célula autoinmune eran similares a las observadas en situación de autoinmunidad en células foliculares del tiroides (Catalfamo 1999).
Otra chaperona implicada en la presentación de péptidos de clase II es la molécula HLA-DO. Esta molécula sólo se expresa en las APC e interviene en el proceso de presentación antigénica modulando la actividad de HLA-DM (Kropshofer 1999; Van Ham 2000). La ausencia de esta molécula en las células epiteliales RIMm5F se corroboró mediante RT-PCR e hibridación con una sonda específica para HLA-DO utilizando RNA total de células RIMm5F y bazo y timo de rata como control positivo (Muntasell 2002).
La distribución celular de HLA-DR, Ii y HLA-DM se determinó mediante microscopía electrónica utilizando criosecciones ultrafinas inmunomarcadas con oro, observándose que los compartimentos intracelulares que contenían las moléculas de MHCII en las células DR4IiDM eran morfológicamente homólogos a los de las células B-LCL. Estos compartimentos pueden clasificarse en seis tipos distintos (Kleijmeer 1997): endosomas tempranos (tipo 1 y 2, rellenos de BSA después de 5 minutos); endosomas tardíos multivesiculares (tipo 3 y 4, rellenos de BSA después de 20 minutos); lisosomas (tipo 5, rellenos de BSA a los 80 minutos); y compartimentos multilaminares (tipo 6, sin BSA a los 80 minutos). La cuantificación de las moléculas de HLA-DR, Ii y HLA-DM en las criosecciones mediante el contaje de las partículas de oro observadas en cada región mostró que cerca del 80% de las moléculas de DR se encontraban en la superficie en ambos tipos celulares, estando el resto distribuido entre los diferentes compartimentos de la vía endocítica. Por otro lado, el patrón de distribución de HLA-DM era similar en ambos tipos
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99 celulares detectándose el mayor número de moléculas en los compartimentos endocíticos de tipo 4, 5 y 6. Sin embargo, en las células B-LCL también se detectó un alto porcentaje de moléculas en los compartimentos de tipo 2. Por el contrario, la distribución de Ii mostraba patrones muy diferentes en los dos tipos celulares. Mientras que en las células epiteliales el 38% de las moléculas se detectaron en la superficie, en las B-LCL únicamente se encontró el 9% situándose la mayor parte de estas moléculas en compartimentos más internos de la vía, principalmente en los de tipo 3 y 4, detectándose incluso en los de tipo 6. Este análisis confirmó además las diferentes relaciones observadas por citometría de flujo entre los niveles de DR Ii y DM en las líneas estudiadas.
2.- REPERTORIO PEPTÍDICO ASOCIADO A HLA-DR4 EN UNA LÍNEA CELULAR CON