Apoptosis 10: 201-208 (2005)
¿Pueden la apoptosis y la necrosis ser definidas mediante el empleo de criterios morfológicos independientemente de la naturaleza de los agentes causantes del daño? Para realizar este análisis, se seleccionó de la literatura un abanico de protocolos capaces de causar apoptosis o necrosis de manera más o menos exclusiva. Los agentes elegidos fueron:
• Los fotosensibilizadores CF3 y ZnPc empleados en condiciones previamente descritas como inductoras de apoptosis y de necrosis.
• Deprivación de suero en el medio de cultivo para inducir apoptosis.
• El agente quimioterapéutico etopósido (VP-16), conocido inductor de apoptosis. • Elevadas concentraciones de H2O2, para inducir necrosis.
• Ciclos repetidos de congelación y descongelación, que necrosan las células del cultivo. Los criterios morfológicos que se emplearon se basaron en observaciones empleando microscopía de contraste de fase, complementadas con análisis de microscopía electrónica de barrido y con observaciones de la morfología nuclear empleando el fluorocromo Hoechst-33258 (H-33258).
Los resultados permitieron determinar que todos los tratamientos utilizados sobre células tumorales HeLa, inducían exactamente el mismo tipo de cambios morfológicos; pero dichos cambios no se daban en escalas de tiempo equivalentes, sino que ciertas fases se producían con grandes retrasos entre unos y otros tratamientos.
Figure 11 Apoptotic morphological development. Upon proper stimulation, cells trigger the apoptotic machinery without larger morphological alterations at the first minutes (A). The apoptotic commitment is evidenced later by the cellular retraction from surface (with lost of pseudopodes), membrane blebbing and chromatin condensation in a crescent-like disposition (B). Finally, in cell cultures, cells detach from surface and became packed into a number of apoptotic bodies compressing both cytoplasmic and
La apoptosis se reconoce fundamentalmente por los cambios dramáticos que sufre la superficie celular. La célula experimenta un proceso de redondeamiento y encogimiento, que se desarrolla sin pérdida de la integridad de membrana pero con la desaparición de las conexiones con las células vecinas. Mientras esto ocurre, en un proceso denominado zeiosis, la membrana sufre reorganizaciones dando lugar a los llamados blebs o evaginaciones macizas de la membrana y del citoplasma subyacente y que, al desprenderse, conforman los cuerpos apoptóticos. El núcleo sufre condensación, marginación y fragmentación de la cromatina. Al completarse toda esta secuencia de acontecimientos, la célula se desprende del sustrato al que estaba adherida.
La necrosis es un proceso mucho menos estudiado que la apoptosis, y el presente trabajo aporta la suficientes evidencias para establecer una serie de fases a través de las cuales el proceso de muerte necrótica se completa, y que permiten una fácil identificación.
Inmediatamente después de actuar el agente lesivo se observan pequeñas evaginaciones (burbujas) en la superficie celular; estas burbujas no son macizas sino hialinas (al estar compuestas básicamente por agua, que
entra descontroladamente en la célula y que se acumula justo por debajo de la membrana plasmática). Pasados unos minutos, las burbujas convergen en una única “macroburbuja” que acaba cerrándose sobre sí misma y desprendiéndose de la célula.
En el momento del desprendimiento de la macroburbuja, la célula sufre la pérdida de la integridad de la membrana plasmática. Sin embargo, el cuerpo celular no sufre redondeamiento ni se despega en ningún momento de la necrosis.
Figure 12 Proposed sequence of events in necrosis development. Living cells (A) quickly show the emergence of several hyaline bubbles into their surface after an intense injure (B). This bubbles converge into a single giant deformation of the plasma membrane (C). These processes occur without any evident morphological change at the nucleus. The water influx that causes cellular swelling (oncosis) finishes when the single giant bubble detaches, rupturing the plasma membrane. When the plasma membrane became holed, an incipient nuclear shrinkage is noticed (D). In our cell cultures, the necrosis process finished with the conformation of “phantoms” by the cell remnants that continue attached to surface. Nucleus shows random disintegration of the genomic material (E).
Hasta el momento de la ruptura de la macroburbuja, los núcleos de las células en necrosis no sufren ninguna alteración morfológica evidente. A medida que pasa el tiempo, la célula va perdiendo todo su contenido soluble a través de una membrana plasmática que está rota; mientras que los componentes insolubles precipitan generando un “fantasma” que retiene la morfología premortem de la célula. Los núcleos muestran una condensación y un encogimiento progresivos (muy evidente al contraste de fase); finalmente estos núcleos picnóticos sufren la ruptura azarosa de la cromatina que se distribuye como estructuras más o menos aisladas por toda la estructura del “fantasma celular”.
Como se ha señalado previamente, todos los tratamientos inducen los mismos cambios morfológicos, variando sólo los tiempos postratamiento en los que se verifican. Así los tratamientos fotodinámicos son más rápidos inductores de apoptosis que la deprivación y el VP-16 (24-48 h vs. 72 h), pero son más lentos inductores de las fases finales de la necrosis (24 h vs. 3 h), ya que la aparición de las burbujas es inmediata al daño.
Con este artículo, en resumen, se defiende la validez de la observación morfológica como herramienta de estudio de la muerte celular frente a la proliferación de técnicas bioquímicas indirectas, asumiendo la necesidad de realizar siempre identificaciones combinadas, ya que ningún criterio o prueba por sí mismo alcanza un 100% de fiabilidad.