Theoretical implications of the study

Para estudiar la potencial regulación de ZEB1 por PKCα se inhibió la función de la misma mediante ARNi para o mediante inhibición farmacológica de PKC totales (PKCs) y clásicas (cPKCs) (Fig.30-32). Se seleccionaron dos líneas celulares de cáncer de mama tipo basales (MDA-MB- 231 y BT549) caracterizadas por su alta expresión de ZEB1 y PKCα, así como una línea celular de cáncer de mama tipo luminal (MDA-MB-453) que presenta niveles de ZEB1 menores que las otras dos líneas, pero altos niveles de las tres isoenzimas de PKCs estudiadas (α, ε y δ) (Fig. 28). Esta última línea fue seleccionada a modo de control, debido a que estudios previos han demostrado que la alteración de la expresión de una isoenzima de PKC puede alterar la expresión de otros miembros de la familia de PKC. Por ejemplo, la sobreexpresión de PKCα altera la expresión de PKCδ y PKCε en varios modelos celulares [113-115].

Se realizó el silenciamiento de PKCα en las líneas celulares anteriormente mencionadas mediante transfecciones transitorias de 2 variantes de ARNi específicos para PKCα (ARNi α1 y α2) por 72 y 96 horas. Debido a que ambos tiempos de silenciamiento arrojaron la misma tendencia, se presentan los resultados obtenidos con el silenciamiento por 72 horas. El análisis por WB de la expresión de PKCs mostró una depleción de PKCα de aproximadamente el 80%. Esto ocasionó una disminución de aproximadamente un 50% de los niveles de ZEB1 en las tres

86 líneas celulares seleccionadas (Fig. 30 y 31 A y C). La caída de la expresión de ZEB1 por silenciamiento de PKCα se corroboró en la línea celular MDA-MB-231 utilizando cuatro ARNi específicos para PKCα adicionales (ARNi α3, α4, α5 y α6) (Fig. 31). Los niveles proteicos de los marcadores de EMT E-cadherina y vimentina, así como el patrón de expresión de PKCε y PKCδ, no mostraron diferencias significativas (Fig.30 A, C y Fig. 31 A, C).

Los resultados presentados hasta el momento sugieren que PKCα podría regular a ZEB1 en líneas celulares de cáncer de mama principalmente en el subtipo basal. Este tipo de tumores se caracteriza por ser triple negativo para receptores hormonales y el receptor de HER-2 (no responden a terapias hormonales) y presentan una alta agresividad y capacidad invasiva. Dada esta potencial relevancia a nivel terapéutico, se continuó indagando acerca de los mecanismos regulatorios de ZEB1 por PKCα en la línea celular MDA-MB-231. Se evaluaron los niveles de expresión del ARNm de ZEB1, PKCα y marcadores de EMT, mediante RT-qPCR en células MDA- MB-231 tratadas con ARNi contra PKCα por 72 horas (Fig. 31 D). Sorprendentemente, en las células transfectadas con el ARNi para PKCα, los niveles de ARNm de ZEB1 no presentaron diferencias significativas en comparación con las células control (NTC) (Fig. 31), a diferencia de lo que ocurre a nivel de expresión proteica. A su vez, las células MDA-MB-231 silenciadas para PKCα presentaron un incremento significativo en los niveles de ARNm de E-cadherina en comparación con el control (NTC) (Fig. 31 C y D). Si bien este incremento no se hizo evidente a nivel proteico, estos resultados sugieren una tendencia incipiente a revertir del fenotipo mesenquimal, la cual puede atribuirse a la disminución proteica de ZEB1 producida por el silenciamiento de PKCα.

87 Figura. 30: PKCα regula la expresión proteica de ZEB1 en líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-453 y BT549.

Las líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-453 (A) BT549 (B), fueron transfectadas con ARNi para PKCα (α1 y α2) por 72 horas. La expresión proteica de ZEB1, PKC (α, ε y δ), E-cadherina, N- cadherina y vimentina se determinó por WB. Los niveles de β-actina fueron utilizados como control de carga. (B)(D) Cuantificación de la expresión proteica de PKCα y ZEB1, normalizada con los valores del control de carga y relativizados al control (NTC). Los resultados se expresan como media ± DE. La diferencia entre las medias fue analizada por ANOVA y test de Dunnett. *p≤0,05 **p≤0,01. La figura es representativa de tres experimentos independientes.

88 Figura. 31: PKCα regula la expresión proteica de ZEB1 y modifica los niveles de ARNm de E-Cadherina en células MDA-MB-231.

Células MDA-MB-231 fueron transfectadas con ARNi para PKCα (α1, α2) (A) o con ARNi para PKCα (α3, α4, α5, α6) (B) por 72 horas. La expresión proteica de ZEB1, PKCs (α, ε y δ), E-cadherina, N-cadherina y vimentina se determinó por WB. Los niveles de β-actina fueron utilizados como control de carga. (C) Cuantificación de la expresión proteica de PKCα, ZEB1 y vimentina fue normalizada con los valores del control de carga y relativizados al control (NTC). (D) Se determinó mediante RT-qPCR la expresión del ARNm de PKCα, ZEB1, E-cadherina y vimentina. Los valores UBC (Ubiquitin C) fueron utilizados para la normalización. Los resultados se expresan como media ± DE. La diferencia entre las medias fue analizada por ANOVA y test de Dunnett.

*p≤0,05 **p≤0,01

***p≤0,0001. La Figura es representativa de tres experimentos independientes (n=3).

Para confirmar estos resultados mediante otra aproximación experimental se recurrió a la inhibición farmacológica de PKCs. Células MDA-MB-231 fueron tratadas por 48 horas con dos inhibidores farmacológicos de PKCs, GF109203 (inhibidor de PKCs total) y GÖ6976 (inhibidor de

89 cPKCs clásicas, dentro de las cuales se encuentra PKCα). Para corroborar el funcionamiento de los tratamientos se valoró el estado de activación de la vía mediante la detección de formas fosforiladas de PKCα/βII y la caída de los niveles totales de PKCα, la cual se induce debido a que las formas fosforiladas de esta proteína son más estables [95].

En coincidencia con los resultados arrojados con el silenciamiento de PKCα por ARNi, la inhibición farmacológica de la vía de PKC condujo a una significativa disminución en la expresión de ZEB1 (Fig. 32 A y B).

Figura. 32: La inhibición farmacológica de la vía de PKC reduce la expresión de ZEB1 en células MDA- MB-231.

Células MDA-MB-231 fueron tratadas con los inhibidores farmacológicos de cPKCs (GÖ 6983) y PKCs total (GF109203) (5µM) o DMSO (control) por 48 horas. La expresión proteica de ZEB1 y PKCα se determinó por WB. Fosfo PKCα/βII se utilizó como control de los tratamientos y los niveles de β-actina fueron utilizados como control de carga. Los resultados se expresan como media ± DE. La diferencia entre las medias fue analizada por ANOVA y test de Dunnett. *p≤0,05 **p≤0,01 ****p≤0,0001. Figura representativa de tres experimentos independientes.