Thermal behaviour of the meadow

II. COMPETENCIAS:

 Reconoce la importancia de los fagos en el desarrollo de la fagoterapia.

 Aísla fagos de la cavidad oral con potencial para el control de microorganismos patógenos orales.

III. MATERIAL Y MÉTODOS: 3.1. Materiales:

a. De Laboratorio:

 Láminas portaobjeto

 06 Beaker de 250 mL limpios.

 01 Asa bacteriológica en anillo.

 Set de Tinción de Gram

 Aceite de inmersión.

 100 mL de Lejía.

 03 Microscopios ópticos.

 Mecheros de alcohol o bunsen.

 Cultivo de Streptococcus pyogenes del grupo A β-hemolítico

 01 L de solución salina fisiológica estéril o PBS.

 100 mL de caldo tioglicolato.

 20 placas con agar sangre.

b. Del alumno (Individual):

 Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables, mascarilla descartable y toca o gorro.

 01 Marcador indeleble.

 01 fosforo o encendedor.

c. Del Alumno (grupal):

 Paquete de hisopos de toma de muestra estériles.

 Paquete de baja lengua.

 Caja de láminas portaobjeto.

3.2. Procedimiento:

3.2.1. Aislamiento e Identificación de Streptococcus pyogenes

1. Se tomarán muestras de hisopado faríngeo-amigdalar de 10 estudiantes presentes en la práctica con la ayuda de un depresor lingual, tocando con la torunda todas las partes con exudados, membranas o inflamación, frotando las criptas tonsilares y la faringe posterior. No se requerirán medidas especiales para su transporte y conservación.

2. Las torundas serán colocadas en caldo tioglicolato para el enriquecimiento y se inocularon a 37°C durante 24 horas, luego se sembrará en placas con agar sangre y se incubará en condiciones ya indicadas anteriormente para el enriquecimiento.

3. Posteriormente se seleccionarán las colonias con β-hemólisis y se colorearán con tinción Gram. La observación de cocos Gram positivos en cadena se utilizará como indicador de Streptococcus. Estas colonias serán sometidas a la prueba presuntiva basada en la susceptibilidad a la inhibición del crecimiento por Bacitracina (0,04U) para confirmar la presencia de Streptococcus pyogenes del grupo A βhemolítico.

4. Los resultados son cualitativos y es positiva si se encuentra cualquier halo de inhibición alrededor del disco.

3.2.2. Aislamiento para bacteriófago

1. Se tomarán 10 muestras de gargarismo faríngeo en frascos de boca ancha con tapa rosca,

estériles, conteniendo 15 mL de solución buffer fosfato (PBS).

2. Se le instruirá al paciente de modo que mantenga la solución en la garganta el mayor tiempo

posible mientras hace gárgaras y deposite nuevamente el líquido en el frasco.

3. Se hará pasar cada una de las muestras por filtro bacteriológico al vacío, y se realizará un paso

de enriquecimiento previo para fagos mezclando 4 mL del filtrado anterior con 5 mL de caldo BHI + Triptosa fosfato 2X y 1 mL de cultivo joven del estreptococo aislado previamente llevándose a incubar a 37°C durante 24 horas.

4. El paso siguiente fue realizar un filtrado bacteriológico del medio de enriquecimiento del paso

anterior y el filtrado se guardará y conservará a 4°C.

5. Con cada filtrado se analizará la existencia del fago, para lo cual, se sembrará al Streptococcus

pyogenes, en camada, sobre una placa de agar sangre y se colocará una gota del filtrado

(fagos). Luego se llevará a incubar a 37 o_{C durante 24 horas. Finalmente se observará la}

presencia o ausencia de placas líticas.

IV. RESULTADOS:

4.5. Aislamiento de bacteriófagos

V. FUNDAMENTACIÓN:

Existe una relación entre la tasa de crecimiento de la bacteria hospedera y el tiempo de aparición del halo lítico. Por lo que aquellas en aquellas cepas bacterianas de crecimiento lento los halos líticos aparecerán más tarde, en tanto que en cepas de crecimiento rápido aparecen a las 24 horas. El habitad del hospedero juega un rol importante y decisivo en el aislamiento de bacteriófagos, porque de las condiciones que se brinde a la célula hospedera a nivel de laboratorio dependerá en gran medida del éxito del aislamiento de dichos bacteriófagos.

La etapa del enriquecimiento previo para el aislamiento del bacteriófago, de los gargarismos faríngeos con cepas de los estreptococos empleados en el presente estudio, se realiza para aumentar el número de las posibles partículas virales (fagos) presentes en los gargarismos empleados ya que estas partículas necesitan células jóvenes para su replicación. En el filtrado final del proceso de enriquecimiento, utilizado para el aislamiento de los fagos, se debe encontrar una concentración de fagos anti Streptococcus

pyogenes del grupo A β-hemolíticos capaz de lisar a las bacterias presentes en el cultivo. Para esto, se

utilizará bacterias del mismo cultivo empleado para el enriquecimiento previo.

La alta especificidad del bacteriófago frente a Streptococcus pyogenes explica esta baja incidencia, pues la lisis de una bacteria por su fago depende tanto de las propiedades de éste, como de los receptores específicos situados en la superficie bacteriana debido a que la multiplicación de los bacteriófagos ocurre sólo cuando el organismo tipo y el fago coinciden La infección es el proceso en el cual el fago reconoce y se adhiere a la célula huésped e inyecta su ácido nucleico atravesando la membrana celular hasta llegar al citoplasma. En el medio ambiente, la infección que es siempre un evento al azar, está altamente influenciada por la densidad bacteriana. Esto quiere decir que a mayor densidad de huésped, mayor oportunidad de infección.

El reconocimiento y la interacción altamente específica entre la célula huésped y el fago hacen parte del proceso inicial de la infección conocido como adsorción. Este evento es afectado por factores como el ambiente iónico y la temperatura. En trabajos donde se añadieron los cationes divalentes Ca+2 y Mg+2 a los ensayos de placa, se observó un incremento en el número y tamaño de las placas virales. De la misma manera, las bajas temperaturas hacen inestable el proceso de la adsorción fago-huésped. Aunque la infección parezca un evento sencillo, hay varios factores o barreras intracelulares como lo son las restricciones específicas del huésped. La carga de la membrana externa, un periplasma con nucleasas y el carácter de la membrana citoplasmática; constituyen un sistema de defensa para la bacteria hacia las moléculas de ADN exógeno, lo que tiene una marcada influencia sobre la aparición de placas líticas sobre un cultivo bacteriano.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

1. Miller, R.V. Environmental bacteriophage–host interactions: factors contribution to natural transduction. Antonie Van Leeuwenhoek 2001; 79 (2): 141 – 147.

2. Hankin, M. E. L'action bactéricide des eaux de la Jumna et du Ganges sur la microbe du choléra, Ann. de l'Inst. Pasteur 1896; 10: 541 – 523.

3. Wagner, P. L. and Waldor, M. K. Bacteriophage teraphy: II. The bacteriophage. Its nature and its therapeutic use. J. Am. Med. Assoc 2002; 116 (21): 60 – 67.

4. Slopeck, S., Weber-Dabrowska, B. Dabrowski, M. And KucharewiczKrukowska, A. Results of bacteriophages treatment of supurative bacterial infections in the years 1981-1986.,Arch. Inmunol. Ther. Exp. 35. 1987.

5. Kleczkowska, J. A cuantitative study of the interaction of bacteriophage with Streptococcus using the technique of pured plates. J. Bacteriol. 1945; 50: 81 – 94.

6. StaniewskI, R. Morphology and general characteristics of phages active against Streptococcus. J. Basic Microbiol. 1987; 27: 155 – 165.

I. INTRODUCCIÓN:

Los hongos corresponden a un reino independiente, son heterotróficos y eucariotas, porque el genoma está organizado en un núcleo envuelto por una membrana contigua al retículo endoplásmico, presentan organelos celulares como mitocondrias, ribosomas, vacuolas, cuerpos lipídicos y otros. De las más de 100.000 especies de hongos descritas, solo 100 son conocidas por participar regularmente en micosis humanas y animales. En la actualidad el reino Fungi, se divide en dos subreinos, Dykaria el cual agrupa las divisiones Ascomycota y Basidiomycota, y el llamado «Hongos Basales», que agrupa al resto de los hongos. Refiriéndose únicamente a los patógenos, dentro del segundo subreino se ubican aquellas especies que antes pertenecían a la división Zygomycota.

Ciertos grupos de hongos se caracterizan por la presencia de su fase levaduriforme en las etapas de su ciclo de vida, mientras que otros se caracterizan por su ausencia. Algunos zigomicetos, ascomicetos y basidiomicetos puede ser dimórficos y pasar de un crecimiento micelial a un crecimiento tipo levadura en ciertas condiciones ambientales. Se reconocen dos tipos de reproducción: sexual y asexual; en la reproducción asexual no participa la cariogamia, la fusión de núcleo y meiosis, tampoco lo hacen los órganos sexuales, en cambio la reproducción sexual se caracteriza por la unión de dos núcleos seguida por meiosis resultando en recombinación y formación de nuevos genotipos.

Dentro de la División Ascomycota, orden Saccharomycetales se encuentra el género Candida, caracterizado como levadura. Se presenta como células redondas u ovoides que miden entre 2,0 a 4,0 µm de diámetro, considerablemente mayor que las cocáceas bacterianas. Las levaduras del género Candida se reproducen por brotamiento o gemación y en determinadas condiciones producen un pseudomicelio filamentoso, la identificación de este género se hace por características morfológicas y fisiológicas, como lo es el test de auxonograma y zimograma. Tienen una distribución amplia en la naturaleza, pudiendo ser encontrados en agua, vegetales, alimentos y otros; en el ser humano forman parte de nuestra microbiota residente.

Dentro del género Candida está la especie Candida albicans que es un comensal común en las membranas de las mucosas de la boca, el intestino y la vagina de individuos sanos, pero puede invadir localmente, causando por ejemplo, candidiasis en niños, vaginitis en mujeres embarazadas y estomatitis subprotésica hasta en un 50% en personas con dentadura postiza. En casos extremos, puede crecer sistemáticamente y causar la muerte después de colonizar la sangre a través de un catéter intravenoso, en el cual las células de levadura se adhieren. El equilibrio entre la infección, la colonización y la eliminación depende de la capacidad de las cepas de Candida para modular la expresión de factores de virulencia en la respuesta a los cambios del medio ambiente, combinado con la competencia del sistema inmune del huésped. Para permitir la invasión a los tejidos del huésped, las cepas de Candida poseen constitutivamente enzimas hidrolíticas que destruyen o alteran los constituyentes de las membranas. Las enzimas secretadas por C.

albicans, que se cree reflejan su grado de patogenicidad, se clasifican en dos tipos principales de enzimas

llamadas proteasas y fosfolipasas.