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La obtención de anticuerpos de elevada afinidad y selectividad frente una determinada molécula, y por tanto la sensibilidad y especificidad de los métodos inmunoanalíticos que se desarrollen a partir de dichos anticuerpos, depende en gran medida del análogo funcionalizado (hapteno) que se utilice en la preparación del

conjugado inmunogénico.117,118 _{La relación estructural y electrónica que existe entre}

la molécula de referencia y el hapteno, y la forma en que el esqueleto de éste se expone al sistema inmune, condicionan la naturaleza del sitio de unión que se generará en el anticuerpo producido. Por lo tanto, es lógico que la etapa inicial de diseño y síntesis de los haptenos sea considerada fundamental en todo el proceso de desarrollo de un inmunoensayo para analitos de bajo peso molecular. Existe consenso en que el diseño del hapteno debe conservar, en la medida de lo posible, la mayoría de las características fisicoquímicas de la molécula de referencia, maximizando la similitud del entorno estérico y electrónico, así como, en el caso de

moléculas flexibles, el grado de libertad conformacional.71,119

Por otro lado, aun cuando hoy en día existen potentes herramientas computacionales de modelado molecular que permiten determinar con precisión las características electrónicas y conformacionales de una determinada molécula, en la práctica el diseño y preparación de una batería de análogos estructurales (haptenos regioisoméricos) es la estrategia más utilizada para la obtención de anticuerpos de elevada afinidad hacia moléculas de pequeño tamaño. Se trata de incorporar el brazo espaciador por diferentes posiciones del analito, conservando al máximo su esqueleto y grupos funcionales, de tal modo que se cubran modos complementarios de presentación del esqueleto de la molécula al sistema inmune. Este tipo de estrategia tiene una ventaja adicional, desde el punto de vista de desarrollo del inmunoensayo final, en cuanto que la batería de haptenos regioisoméricos sintetizados puede también utilizarse para la preparación de conjugados de ensayo usados en estrategias de heterología, que como se ha comentado en la

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introducción permiten frecuentemente una mejora de la sensibilidad del inmunoensayo.

Para el diseño de los haptenos de anatoxina-a se han tenido en cuenta varios aspectos. La anatoxina-a es una molécula de pequeño tamaño con dos grupos funcionales reactivos; por un lado, el grupo amino puente del sistema bicíclico, de carácter básico y con capacidad nucleofílica para interaccionar con centros ácidos y/o electrofílicos; y por otro, la agrupación cetónica α,β-insaturada, potencialmente susceptible de experimentar fácilmente adiciones tipo Michael con nucleófilos

adecuados,120,121,122 _{tales como algunos que pueden estar presentes en el medio}

fisiológico natural durante el proceso de inmunización, por ejemplo los grupos sulfhidrilo presentes en moléculas como el glutatión o las propias proteínas. Todas estas características estructurales y reactivas de la anatoxina-a pueden estar relacionadas con el hecho de que, hasta el momento, y a pesar de su elevado interés tecnológico, no se hayan obtenido anticuerpos adecuados para el desarrollo de un inmunoensayo que permita la detección sensible de la misma.

En base a estas consideraciones, y previamente a la planificación de los haptenos a sintetizar, se llevó a cabo un estudio de la capacidad de reacción de anatoxina-a con un nucleófilo del tipo indicado en el párrafo precedente. Como modelo de nucleófilo se utilizó el ácido 4-mercaptofenilacético, MPAA (Esquema 3.1); la anatoxina-a se trató con el mencionado tiol (1.5 equiv) en tampón fosfato (100 mM, pH 7.4) a temperatura ambiente y con agitación magnética, y se controló la evolución de la reacción por HPLC-MS a los 15 min, 2 h, 4 h y 23 h.

El resultado de este experimento indicó que la anatoxina-a reacciona rápidamente (15 minutos) con el tiol para dar el producto de adición conjugada a la agrupación enona, si bien el producto de adición evoluciona aparentemente en estas condiciones de forma reversible para regenerar parcialmente después de 23 h la anatoxina-a de partida, un proceso que parece estar propiciado por la oxidación irreversible del tiol al correspondiente disulfuro y que con el tiempo desplazaría el

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Esquema 3.1. Reacción de anatoxina-a con tioles

Aunque es aventurado extrapolar el resultado obtenido en estas condiciones de

reacción a las condiciones fisiológicas in vivo que se dan en el proceso de

inmunización, pensamos que podría ser interesante aprovechar la reactividad de la anatoxina-a con los grupos sulfhidrilo para generar un derivado tiolado de la misma, con una estructura genérica como la representada en la Figura 3.1, hapteno

ANs, a sabiendas de que tanto desde el punto de vista de similitud estructural de

este hapteno con anatoxina-a, como por los resultados obtenidos en la reacción in

vitro, no se tenían garantías de que este tipo de derivado fuese el más adecuado para inducir la respuesta inmune deseada.

Figura 3.1. Estructura de hapteno ANs

Adicionalmente a este tipo de hapteno, y siguiendo una aproximación más racional, también se diseñaron otros haptenos en los que se respeta íntegramente el esqueleto y grupos funcionales de anatoxina-a, incorporando un brazo espaciador

hidrocarbonado sobre el átomo de nitrógeno, hapteno ANn, el grupo carbonilo,

hapteno ANc, y el grupo metilo, hapteno ANm (Figura 3.2). La similitud estructural

de los haptenos ANn y ANm con anatoxina-a es obvia, ya que en ambos casos el

brazo espaciador está situado en posiciones de la misma que no comprometen seriamente la libertad conformacional del esqueleto que comparten con

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anatoxina-a, habiéndose escogido una longitud relativamente corta del

brazo espaciador, cuatro átomos de carbono, para posibilitar una adecuada separación del resto proteico durante la presentación al sistema inmune del conjugado inmunogénico, sin que se produzca un excesivo reconocimiento de la propia cadena del brazo espaciador en relación al esqueleto de anatoxina-a.

Figura 3.2. Estructura de los haptenos ANn, ANc y ANm

En el caso del hapteno ANc, se sustituye la agrupación enona de anatoxina-a

por una agrupación oximínica α,β‒insaturada, un intento de reducir la reactividad del doble enlace en reacciones de adición tipo Michael, y se reduce drásticamente la longitud del brazo espaciador a dos átomos de carbono al objeto de que el reconocimiento molecular en los sitios de unión de los anticuerpos generados se centre en la parte del esqueleto común con anatoxina-a.

Finalmente, y ante la posibilidad de que el reducido tamaño de anatoxina-a condicionase en exceso la generación de anticuerpos de elevada afinidad, se ha abordado también el diseño de un hapteno correspondiente a un derivado de la misma. Mediante esta estrategia se pretende incrementar el tamaño de la molécula

vii Desde el punto de vista inmunológico, es importante la posición de anclaje del hapteno a la

proteína, y por lo tanto del brazo espaciador en el mismo. Se han descrito ejemplos en los que brazos espaciadores unidos directamente o en posiciones próximas a los grupos funcionales producen anticuerpos de baja afinidad75,123 _{y otros con un resultado contrario.}124 _{Haptenos de este}

último tipo se han utilizado, por ejemplo, para la generación de anticuerpos frente a moléculas relevantes como cocaína, microcistinas o nodularinas.125,126

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a detectar, lo que debería aumentar sustancialmente su carácter inmunogénico. En este caso, y suponiendo que pueden obtenerse anticuerpos adecuados frente al derivado de anatoxina-a, la determinación de la toxina mediante un inmunoensayo implicaría una etapa previa adicional de derivatización, un procedimiento que, por otro lado, es bastante común en diversas metodologías analíticas utilizadas para la

cuantificación de anatoxina-a127 _{y otros analitos de bajo peso molecular,}128,129,130 _y

que también se ha utilizado en el contexto de procedimientos analíticos basados en

anticuerpos.131,132,133

A la hora de diseñar un derivado adecuado de anatoxina-a para utilizarlo como hapteno se han tenido en cuenta los diferentes tipos de reactivos que han sido utilizados para su derivatización en los procedimientos de análisis basados en HPLC y GC, y que ya han sido comentados en la introducción. Uno de los reactivos más utilizados para la derivatización de anatoxina-a con este fin es el 4-fluoro-7-nitro-

2,1,3-benzoxadiazol (NBD-F),126 _{un agente derivatizante muy reactivo que reacciona}

con aminas primarias y secundarias en condiciones muy suaves originando

derivados fluorescentes.134 _{Desde el punto de vista de la reactividad, un compuesto}

relacionado con NBD-F es el conocido como reactivo de Sanger (1-fluoro-2,4-

dinitrobenceno, 2,4-FDNB),135,136,137el cual también puede reaccionar con aminas para

dar el correspondiente producto de adición-eliminación. Aunque no ha sido utilizado para la derivatización de anatoxina-a en procedimientos analíticos cromatográficos, pensamos que podría ser adecuado como agente derivatizante en el contexto del desarrollo de un inmunoensayo para un derivado de anatoxina-a. Al objeto de evaluar la viabilidad de este reactivo como agente derivatizante, llevamos a cabo un estudio preliminar de esta reacción.

En los primeros ensayos de derivatización se hizo reaccionar anatoxina-a, en forma de sal del ácido triflouroacético, con 5.0 equivalentes de 2,4-FDNB en borato sódico 0.1 M, pH 9.6, a temperatura ambiente, controlándose la evolución de la reacción por HPLC en fase reversa, tal como se detalla en la parte experimental (apartado 5.4.1). En estas condiciones se apreció una reacción lenta entre la anatoxina-a y el reactivo de Sanger para generar el correspondiente producto de

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sustitución nucleofílica del átomo de flúor, compuesto AN–DNB (Esquema 3.2). Sin embargo, la velocidad de la reacción se incrementó notablemente cuando el medio de reacción se sustituyó por una mezcla 1:1 de tampón borato y acetonitrilo, de tal modo que en este nuevo medio la reacción prácticamente se completó en 15 minutos. Experimentos posteriores mostraron que la cantidad de acetonitrilo podía reducirse al 10% sin que se observaran cambios sustanciales de la velocidad de reacción. Este último aspecto es particularmente relevante, puesto que son condiciones en las cuales son solubles las proteínas y anticuerpos y, por lo tanto, compatibles con el desarrollo de un inmunoensayo sin tener que diluir la muestra a analizar.

Esquema 3.2. Reacción de anatoxina-a con 1-fluor-2,4-dinitrobenceno

A la vista de los resultados obtenidos en la reacción de anatoxina-a con el reactivo 2,4-FDNB, parecía que este compuesto podría ser adecuado como agente derivatizante en el desarrollo de un inmunoensayo de anatoxina-a basado en la derivatización previa de la misma. En base a este supuesto, se consideró que podrían generarse anticuerpos adecuados para el reconocimiento de este derivado utilizando como hapteno un análogo del mismo con la estructura mostrada en la

Figura 3.3, hapteno ANd.

Es de esperar que la estructura de este hapteno, que incorpora dos elementos estructurales potencialmente muy inmunogénicos, como son las agrupaciones nitrobenceno y sulfonamida, mimetice adecuadamente la estructura del derivado AN-DNB y sea capaz por tanto de inducir la generación de anticuerpos específicos y selectivos para el mismo.

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Figura 3.3. Hapteno ANd, análogo estructural del

derivado de anatoxina-a con 2,4-FDNB