En aquest treball, la majoria de recombinacions homologues s’han realitzat en llevats, degut a l’elevada freqüència de recombinació que presenten aquests organismes. Per tal de poder amplificar els plasmidis en llevats, caldrà introduir en els plasmidis emprats els elements necessaris per la replicació en llevats, així com un marcador de selecció que estigui mutat o delecionat en la soca de llevats emprada. En aquest treball, la seqüència CAU ha estat introduïda en tots els plasmidis que s’han requerit per la construcció d’adenovirus recombinants. La seqüència CAU consta d’un Centromer, un origen de replicació en llevats, o seqüència de recombinació autònoma (ARS), i el gen URA3 (gen delecionat en la soca de llevats emprada), que codifica per l’enzim orotidina-5’-fosfat decarboxilasa, necessari per la biosíntesi d’uracil. Els plasmidis obtinguts per recombinació homòloga en llevats són de baixa còpia (1-3 còpies/ cèl·lula) i per tant la seva amplificació s’haurà de dur a terme en soques bacterianes. Així doncs, aquests plasmidis, a part de contenir el gen CAU, hauran de contenir l’origen de replicació bacterià i el gen de resistència a antibiòtics.
Els llevats emprats en aquest treball pertanyen a la soca de Saccharomyces cerevisiae
YPH857. Aquesta soca ha estat modificada genèticament, de manera que presenta mutacions o delecions de gens implicats en la síntesi de diferents aminoàcids (ura3-53, lys2-801, ade2-101, his3-200, trp1-63, leu2-1cyh2R). Aquestes mutacions fan que els llevats de la soca YPH857 siguin incapaços de créixer en medis deficients en uracil, lisina, adenina, histidina, triptòfan i leucina. La selecció dels llevats amb els plasmidis recombinants es farà en medis que continguin tots aquests aminoàcids, a excepció de l’uracil.
Per a poder realitzar les recombinacions homologues, els dos DNA’s d’interès es van transformar linealitzats a les cèl·lules de llevat, a les quals, s’havia induït prèviament, l’estat de competència. L’homologia necessària perquè es doni la recombinació homologa en llevats entre un plasmidi linealitzat i el fragment a inserir de forma eficient és de 40 pb a cada extrem.
2.1. PREPARACIÓ DE LLEVATS COMPETENTS
L’estoc mare de llevats de la soca YPH857 es conserva congelat a -80ºC en forma de glicerinat. Quan es va necessitar fer recombinacions homologues en llevats, es va rascar el glicerinat amb una punta de pipeta i es va dibuixar una estria en una placa d’agar amb medi ric pel creixement de bactèries, el YPDA++. Els llevats, es van deixar créixer a 30ºC durant tres dies, i la placa amb el creixement de llevats es va guardar a 4ºC. Cada dues setmanes, les plaques
57
s’eliminaven, i es feien créixer llevats de nou en una altra placa, per tal els llevats estiguessin sempre frescos.
A l’hora de fer els llevats competents, es picava una colònia de llevats de la placa de YPDA++ i es feia créixer durant tota la nit en 5 ml de YPDA++ líquid a 30ºC en agitació, a 200 rpm. El dia següent es mesurava la OD d’una dilució 1/10 del cultiu (OD600=1 equival a 1.5x107
cèl·lules/ml) i es preparava una suspensió de llevats que tingues una OD=0.15 en un volum de 50 ml (OD600= 0.15 equival a 2.25x106 cèl·lules/ml). La suspensió es deixava créixer a 30ºC i 200
rpm fins obtenir una OD600= 0.4 to 0.9 (aprox. 5 h). A continuació, la suspensió de llevats es
traspassava a un falcon de 50 i es centrifugava a 3000 g durant 5 minuts en una centrifuga HermleZ383k a temperatura ambient. El sobrenedant es descartava, i el pelet es rentava amb 25 ml d’aigua miliQ autoclavada. El rentat es tornava a centrifugar a 3000 g durant 5 min, el sobrenedant es descartava, i el pelet es resuspenia en 1 ml d’aigua. La suspensió es traspassava a un ependorf de 1.5 ml i es centrifugava 30 segons a 5000 rpm en una microcentrífuga. El sobrenedant es tornava a descartar, i el pelet es resuspenia amb aigua a un volum final de 1 ml. A partir d’aquesta suspensió, es feien alíquotes de 100 μl (108 cèl·lules), que es centrifugaven durant 30 segons a 5000 rpm en una microcentrífuga. El sobrenedant es descartava, i el pelet de llevats ja estava disponible per ser transformat amb el DNA.
2.2. TRANSFORMACIÓ DE LLEVATS PEL MÈTODE LIAC/SS-CARRIER DNA/PEG.
Per tal de transformar els llevats competents, s’ha utilitzat el mètode del LiAc/SS-carrier DNA/PEG descrit per Daniel Gietz i Robin A. Woods (Gietz and Woods 2002). Aquest mètode es basa en l’ús de l’acetat de liti per a desestabilitzar les membranes del llevat, l’ús d’un DNA de cadena simple (ss-carrier DNA) per a bloquejar possibles zones repetides on es podria unir de forma inespecífica el DNA a transformar, i en la introducció del DNA mitjançant un xoc tèrmic.
Breument, abans de tot, es bull el DNA de cadena simple (DNA de l’esperma de salmó), durant 5 min a 95ºC. A continuació, per cada transformació, es prepara una barreja que contingui:
PEG (50%, w/v) 240 μl
Acetat de liti (1M) 36 μl DNA de salmó (10mg/ml) 10 μl Plasmidis de DNA + H20 (milliQ) 74 μl
La barreja s’afegeix al pelet de llevats competents acabats de preparar, es barreja amb l’ajuda del vòrtex, i s’incuba durant 40 minuts a 42ºC. Passat aquest temps, la barreja es centrifuga 30 s a 5000 rpm i s’elimina el sobrenedant. El pelet de llevats es resuspén amb 100 μl d’aigua i es plaqueja en una placa d’agar amb medi SC Ura-. Les plaques s’incuben a 30ºC
durant dos dies, passats els quals apareixeran a la placa unes colònies petites i blanques que correspondran als plasmidis recombinants.
2.3. AÏLLAMENT DE DNA PLASMÍDIC
L’aïllament del DNA plasmídic es va realitzar a partir de cultius de llevats crescuts a partir d’una colònia durant 20 h a 30ºC i 200 rpm en 2ml del medi de selecció líquid SC Ura-. Breument, es traspassen 1,5 ml del cultiu a un ependorf de 1,5 ml i es centrifuguen durant 5 segons a màxima velocitat. El sobrenedant es descarta, i el pelet de llevats es resuspén amb 400
l d’una solució que conté: 2% Tritó-X100, 1% SDS, 0,1 M NaCl, 10mM TrisHCl pH 8.0, 1mM EDTA. A continuació, s’hi afegeixen400 l d’una solució fenol-cloroform i 0,3g de boles de vidre (glass beads, unwashed, Sigma). La mescla es barreja durant 2 minuts en un vòrtex vertical a 4ºC i es centrifuga 5 min a 12000 rpm. El sobrenedant es traspassa a un ependorf nou i el DNA plasmídic es precipita amb 2 V d’etanol al 2% d’acetat sòdic, durant 30 min a -20ºC. Passat aquest temps, el DNA plasmídic es centrifuga durant 20 min a 13000 rpm a temperatura ambient. El sobrenedant es descarta, i el pelet es renta amb etanol al 70%. Finalment, el pelet de llevats es resuspén en 40 l d’aigua.
Per tal d’amplificar el DNA plasmídic, es transformen 2 l de la minipreparació de plasmidi en llevats en la soca bacteriana DH5 pel mètode de l’electroporació.
59