• Recuento inicial de inóculo: El inóculo inicial se mantuvo en 106 UFC/mL en las condiciones establecidas inicialmente para cada cepa. Se realizó coloración de Gram para verificar pureza como se observa en la Tabla 7, en donde se evidenció la morfología característica de esta levadura sin contaminación
Tabla Nº 7. Coloración de Gram y valores de absorbancia 620 nm de inóculos y de cepa A
(estudio) y cepa B (control)
Cepa Microscopía observada a partir de la coloración de Gram Absorbancia del inóculo
620nm
A Levaduras sin contaminación microbiana 0.866
B Levaduras sin contaminación microbiana 0.874
Después del período de incubación, en el agar YPG, se evidenciaron colonias grandes de aproximadamente 1 a 2 mm de diámetro, convexas, lisas, de bordes definidos y brillantes.
Tabla Nº 8. Siembra en superficie en agar YGC de inóculos de cepa A (estudio) y cepa B (control)
CEPA UFC/mL
A 5.00E +07
B 4.10E +07
• Reducción del colesterol: Se determinó la concentración inicial de colesterol experimental midiendo el valor de absorbancia550nm el cual fue de (0.839), este fue
reemplazado en la ecuación de la recta y se obtuvo un dato correspondiente a 221,2 μg/mL. Posteriormente, se procesaron las muestras de la cepa A (estudio) y la cepa B (control), encontrándose para la primera un valor promedio de absorbancia de 0.303 y de 0.265 para la segunda y no se observó diferencia estadísticamente significativa (p > 0.05) entre ambas cepas. Estos valores fueron despejados en la ecuación de la recta obtenida de la curva patrón y se obtuvieron datos correspondientes al colesterol residual en la muestra, siendo de 102 μg/mL (cepa A) y de 93.64μg/mL (cepa B). Con estos valores se determinó el colesterol degradado restando de la concentración inicial experimental (221.2 μg/mL).
Posteriormente, se procesaron las muestras de la cepa A (estudio) y la cepa B (control), encontrándose para la primera un valor promedio de absorbancia de 0.303 y de 0.265 respectivamente, valores que se reportan en el Anexo Nº 6.3. Estos valores fueron despejados en la ecuación de la recta obtenida de la curva patrón (y =0.0045x – 0.1564, R2= 0.9937) y se obtuvieron datos correspondientes al colesterol residual en la muestra, siendo de 102 μg/mL (cepa A) y de 93.64μg/mL (cepa B). Con estos valores se determinó el colesterol degradado, como se observa en la Tabla 9.
Tabla Nº 9. Valores de colesterol degradado en 12 horas de incubación por la cepa A (estudio) y la cepa B (control)
Colesterol degradado / 12 horas de incubación
Cepa A 119.2μg/mL
• Porcentajes de asimilación de colesterol: después de determinar la cantidad de colesterol degradado, se determinó el porcentaje de asimilación de cada cepa, de acuerdo a la fórmula del numeral 5.1.2.4.
Los resultados obtenidos se observan en la Tabla Nº 10.
Tabla Nº 10. Porcentajes de asimilación de colesterol/12 horas de incubación por la Cepa A (estudio) y la Cepa B (control)
Cepa Porcentaje de
asimilación/12 horas
A 54% B 58%
De acuerdo a lo que se presenta en los resultados se puede observar que las dos cepas de levaduras en evaluación fueron capaces de asimilar más del 50% del colesterol presente en el medio en 12 horas de incubación. Esto se corrobora con estudios como el realizado por Psomas et al (2003) en donde varias cepas de S. cerevisiae luego de 48 horas de incubación a 37oC mostraron un porcentaje de asimilación del 100 %.
Los resultados obtenidos muestran que la cepa en estudio es capaz de reducir el colesterol, característica que es deseable, ya que para humanos la hipercolesteremia o elevados niveles de colesterol en la sangre, es considerada como el mayor riesgo del desarrollo de enfermedades al corazón y en animales, la menor presencia de colesterol genera mejores carnes, de elevada calidad y de mayor demanda, al encontrarse libres de grasas. La administración de probióticos ha demostrado que puede reducir notablemente los niveles de colesterol (De Smet et al, 1998, Du Tuit et al, 1998, Taranto et al, 1998).
Es importante la adición de las sales biliares al medio de cultivo adicionado de colesterol, ya que cuando estuvieron ausentes, no fue posible realizar la extracción de las muestras para la curva patrón. Lo anterior debido a que las sales biliares se encuentran presentes en el organismo en actividades de emulsión, solubilización y absorción de lípidos en el intestino (Begley, 2006).
Los métodos de determinación del colesterol incluyen el analizar las muestras por cromatografía de gas, al ser un método confiable, rápido y eficaz (Fleutoris et al, 1998). Sin embargo, cuando no se cuenta con esta opción existe un protocolo basado en la reacción de Liebermann – Burchard, en la que posterior a la adición del hexano, se adiciona ácido glacial
acético el cual reacciona con el grupo C3 hidroxilo del colesterol en presencia de ácidos fuertes (ácido sulfúrico concentrado) y forma el complejo azul-verdoso y en su defecto rojo/café que se evidenció durante el montaje como se observa en la Figura Nº 17 (Skoog, 1998).
De lo anterior, se concluye que este protocolo de extracción es adecuado, ya que permitió obtener valores de colesterol en relación a los valores de Absorbancia (550 nm), ya que al realizar la curva patrón se obtuvo un R2 igual a 0.9937, lo que evidenció que los datos se relacionaban entre sí, además los resultados obtenidos en la determinación de la reducción del colesterol pudieron ser correlacionados con el reportados por Psomas et al (2003).
Figura Nº 17. Reacción de Liebermann – Burchard para determinación de Colesterol. Fuente (Autores, 2007)
• Sonicación: Las levaduras en Medio YPGCHO y caldo YPG después de 12 horas de incubación fueron sometidas a sonicación por períodos de 0, 1, 2 y 3 minutos, posterior al periodo de incubación se realizaron recuentos en cámara de Newbauer. El objetivo de esta prueba fue verificar si efectivamente las levaduras asimilaban el colesterol a su membrana alterando su estructura y confiriéndole mayor resistencia a condiciones de estrés tal como la lisis celular generada por este protocolo, por lo que al exponer el microorganismo a este método de disrupción, se esperaba que las levaduras inoculadas en medio mas colesterol cambiarán la morfología de la membrana presentando recuentos más altos en comparación con aquellos que no fueron inoculados en medio suplementado.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 Tiempo (minutos) L og Le v a dur a s /m L
Cepa A con colesterol Cepa A sin colesterol
Figura Nº 18. Recuentos (Levaduras/mL) de Cepa A (estudio) expuesta a sonicación
En ambas cepas se observaron recuentos mayores (Levaduras/mL) cuando estas habían sido inoculadas en medio YPGCHO en comparación con los recuentos de levaduras que habían sido inoculadas en medio sin suplemento de colesterol. Para la cepa A, como se observa en la Figura 18, se obtuvieron valores en la escala de 106 levaduras/mL para el tiempo 0, lo que confirma que el microorganismo sigue viable tanto en el medio con colesterol o sin ser suplementado, sin embargo al ser expuesta S. cerevisiae a la sonicación por 1 y 2 minutos se observó que la viabilidad de la cepa disminuye en una unidad logarítmica, ya que se reportan valores de 105 levaduras/mL, siendo levemente más altos los valores de la cepa inoculada en Medio YPGCHO; para el tiempo 3 incluso disminuye drásticamente la viabilidad hasta 102 levaduras/mL en el caldo inoculado sin suplemento de colesterol a diferencia de la levadura en medio suplementado, que sigue conservando la viabilidad en 105 levaduras/mL.
Resultados similares se observan en la Figura 19, para los recuentos de la cepa B, presentándose disminución en la viabilidad tras la sonicación, siendo siempre más altos los valores de S. cerevisiae var. boulardii (cepa B) inoculada en Medio YPGCHO, que en caldo YPG sin adición de colesterol, para el último tiempo se observa igual la disminución hasta 102 levaduras/mL.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 Tiempo (minutos) Lo g Le v a d ur a s /m L
Cepa B con colesterol Cepa B sin colesterol
Figura Nº 19. Recuentos (Levaduras/mL) de Cepa B (control) expuesta a sonicación
De acuerdo al estudio realizado por Psomas et al (2003) se sabe que posiblemente la reducción del colesterol en un medio con levaduras, se deba a que estos microorganismos asimilan el colesterol para incorporarlo a su estructura, reportándose que las levaduras expuestas a medio de cultivo enriquecido con colesterol eran más difíciles de lisar tras ser sometidas a sonicación que las levaduras que no crecían en el medio enriquecido con colesterol, lo que sugiere un posible cambio morfológico en la pared (Kollár et al, 1997), ya que el microorganismo al incorporar este esterol a su estructura se hace más resistente a la lisis celular, comparado con los que no lo que no lo incorporan.