Training and adjustment programmes for older workers

1.

TDZ

1.1.

Determinación de la citotoxicidad y genotoxicidad

Para que un compuesto orgánico pueda ser usado como inhibidor de la corrosión de biomateriales dentales metálicos, debe poseer baja toxicidad y no provocar reacciones adversas en el organismo y debe ser ecológicamente benigno (Capítulo I, SECCIÓN E, inciso 1. Inhibidores de la corrosión y formación de películas protectoras). Por lo tanto, se determinó el límite de toxicidad de TDZ antes de evaluar su efectividad como inhibidor de la corrosión en medios biológicos simulados (saliva sintética).

Síntesis de TDZ. TDZ se sintetizó, purificó e identificó según el

procedimiento propuesto por nuestro grupo de trabajo (Svartman EL y col., 2006).

Solventes y soluciones empleadas. TDZ se solubilizó en DMSO

Merck p.a. (Química Argentina SAIC, BA, Argentina), para luego ser diluido en el MCC. El intervalo de concentraciones de TDZ investigado se seleccionó de manera de incluir la concentración (0,65 µM) a la cual dicho compuesto resultó con poder inhibidor sobre la corrosión de cobre en medio ácido

(Barbosa MR y Mirífico MV, 2006; Becker MD y col., 2004; Jordán Dansilio

MA, 2004; Becker MD, 2004; Montaña AN, 2003); y concentraciones más altas que pudieran ser utilizadas para alcanzar un mayor efecto protector. Las concentraciones de TDZ estudiadas fueron: 0,57; 1,16; 1,72; 2,94; 5,63 y 12,50 µM. La concentración final del solvente DMSO en el medio de cultivo no superó el 1% v/v para todos los tratamientos en los distintos ensayos.

Cultivo celular. Para los ensayos de citotoxicidad se utilizó la línea celular CHO-K1 que se obtuvooriginalmente del Banco Americano de Células (ATCC, Rockville, MD, USA). Las células se sembraron, crecieron y mantuvieron según lo descrito en Capítulo III, SECCIÓN A, inciso 1. Aleación base cobre, con la salvedad de que en este caso se utilizó el medio de cultivo Ham-F10 (GIBCO-BRL, Los Ángeles, Estados Unidos) enriquecido de igual manera que el medio D-MEM (medio de cultivo completo). Simultáneamente a los cultivos en presencia de TDZ se incluyeron los controles negativos (cultivos sin tratamiento y tratados con el solvente DMSO 1% v/v) y positivos (cultivos tratados con etanol 7% v/v).

Técnicas empleadas. Ensayos de rojo neutro (RN), aberraciones

cromosómicas (AC), índice mitótico (IM) y formación de colonias (FC).

El agua empleada para la preparación de todas las soluciones, medios biológicos, limpieza, lavado y otros procedimientos, fue también para esta parte del trabajo de tesis doctoral, agua bidestilada y desionizada por el sistema Milli Pore-MilliQ.

1.1.1. Ensayos de citotoxicidad

1.1.1.1. Rojo Neutro

Para este análisis se sembraron en placas de 96 pozos 2,7 x 103 células/pocillo y se cultivaron en medio Ham-F10 completo. Las células crecieron, durante 4 h, según lo descrito en Capítulo III, SECCIÓN A, inciso1.2.3. Citotoxicidad de los iones metálicos: ensayo de rojo neutro.

Transcurrido este tiempo, se removió el medio de cultivo y se adicionaron 100 µL de MCC conteniendo una concentración conocida de TDZ (Figura III.4). Después de 24 h, se continuó con el ensayo tal como se describe Capítulo III,

SECCIÓN A, inciso1.2.3. Citotoxicidad de los iones metálicos: ensayo de rojo neutro. El porcentaje de citotoxicidad se calculó según la ec. III.1.

1.1.1.2. Formación de colonias celulares

Para este análisis se siguieron los mismos pasos y se trabajó en las condiciones detalladas en Capítulo III, SECCIÓN A, inciso 1.2.2. Efecto de los iones metálicos liberados: ensayo de formación de colonias celulares; pero se utilizó el medio de cultivo Ham-F10 completo conteniendo diferentes concentraciones de TDZ (Figura III.5). Luego de 7 días de incubación, se removió el medio de cultivo y se lavaron las células adheridas con SBP. Las colonias se fijaron según lo descrito en Capítulo III, SECCIÓN A, inciso1.2.2.

Efecto de los iones metálicos liberados: ensayo de formación de colonias celulares; y tiñeron con Giemsa. El porcentaje de supervivencia celular se calculó según la ec. III.2.

[a / b] × 100 (ec. III.2)

donde a corresponde al número de células vivas tratadas con TDZ y b al de células vivas en el control negativo tratadas con DMSO.

1.1.1.3. Análisis estadístico de los datos

Los datos se analizaron usando la prueba de One-way-ANOVA y la de comparaciones múltiples; esta última se llevó a cabo realizando el ajuste

Figura III.5. Cultivo de células CHO-K1, expuestas a diferentes concentraciones (0,57 –

12,5 M) de TDZ, durante 7 días, a 37  2 °C.

Figura III.4. Cultivo de células CHO-K1, expuestas a diferentes concentraciones (µM) de TDZ, durante 24 h, a 37  2 °C.

de los valores p por el método de Bonferroni (Martín Andrés A y Luna del Castillo JD, 2004). El análisis estadístico se realizó con el programa Statistica

7.0 (Statsoft, Inc., Tulsa, OK).

1.1.2. Ensayos de genotoxicidad

1.1.2.1. Pruebas de aberraciones cromosómicas estructurales e índice mitótico

Para estos ensayos se sembraron 3,5 x 103 _{células/mL en frascos}

T-25, en medio de cultivo completo (Ham-F10) conteniendo diferentes concentraciones de TDZ. (Figura III.6) Las células se incubaron durante 12 h, y 2 h antes de la fijación se agregó colchicina (Merck) al medio de cultivo (concentración final 0,1 µg/mL) para detener la división celular en metafase. Las células se fijaron con metanol absoluto:ácido acético glacial (3:1) y se extendieron utilizando la técnica de secado al aire siguiendo protocolos de rutina (Tjio J y Levan A, 1956). Posteriormente se llevó a cabo la observación al microscopio (ver Capítulo III, SECCIÓN A, inciso 1.1.2) con un objetivo 10x y se evaluaron para aberraciones cromosómicas estructurales un total de 300 metafases por tratamiento (100 por repetición) y para el índice mitótico un total de 3000 células por cada punto experimental. Los cambios en el IM se expresaron como un factor (f) (ec. III.3) definido como la relación entre el IM de las células tratadas (IMt) y el IM de las células control tratadas con DMSO

IMc). (Miller BM y Adler ID, 1998)

f = IMt / IMc (ec. III.3)

Figura III.6. Cultivo de células CHO-K1, expuestas a diferentes concentraciones de TDZ (0 –

1.1.2.2. Análisis estadístico de los datos

SECCIÓN C

EFECTO DE LOS COMPUESTOS ORGÁNICOS COMO