The third transition: 1977 to 1980, the Janata Government

Necroptosi és el tipus de necrosi regulada més reportat darrerament a nivell de recerca de molècules implicades en les vies de senyalització d’aquesta modalitat de mort necròtica. Inclou els casos de necrosi regulada depenents de les quinases RIP1 i/o RIP3. El descobriment de l’inhibidor químic necrostatina-1 en la quinasa RIP1, ha identificat en els darrers anys gran quantitat de processos de mort necroptòtics (Degterev, Huang et al. 2005; Degterev, Hitomi et al. 2008). No obstant, els casos de necroptosi depenents de RIP3 i independents de RIP1 no es poden evitar per l’inhibidor químic, i són igualment considerats processos de mort necroptòtics (Upton, Kaiser et al. 2010). Inclús, es postula sobre altres possibles dianes de l’inhibidor químic en la mort necroptòtica (Cho, McQuade et al. 2011).

El principal avanç en la cerca de molècules implicades en les vies de senyalització necroptòtica, s’ha analitzat en la lligació del receptor de mort de TNF en absència d’activació de caspases (Vercammen, Beyaert et al. 1998). En particular, el model necroptòtic en el lligand de mort TNF es desencadena amb la inhibició química o el knockdown de la caspasa iniciadora caspasa-8 (Holler, Zaru et al. 2000). La senyal necroptòtica s’inicia, llavors, en el moment que el complexe transmembranal del receptor de mort (complexe I) es desubiquitina a nivell de la quinasa RIP1, per acció d’enzims desubiquitinadors tals com CYLD (cylindromatosis) o bé, per efecte de la inhibició dels seus ubiquitinadors directes, com són les cIAPs (Hitomi, Christofferson et al. 2008; Varfolomeev, Goncharov et al. 2008). Al seu torn, l’estat desubiquitinat del complexe I no permet reclutar el complexe ubiquitinador LUBAC (linear ubiquitin chain assembly complex) capaç d’estimular la via de supervivència NF-kB (Tokunaga, Sakata et al. 2009).

En cas d’insult apoptòtic, es coneix que la desubiquitinació del complexe I permet a RIP1 reclutar la molècula adaptadora FADD i la caspasa 8, per la constitució del complexe citosòlic II i el conseqüent desencadenament de la via apoptòtica (Micheau and Tschopp 2003). No obstant, si RIP3 hi és present i caspasa-8 està inactiva, es promou la formació del complexe citosòlic IIb anomenat necrosoma (Holler, Zaru et al. 2000; Cho, Challa et al. 2009). Per la transducció de la senyal necroptòtica, es requereix que caspasa-8 estigui inactiva, ja que aquesta pot inhibir RIP1 i RIP3 per processament proteolític (Feng, Yang et al. 2007; Vandenabeele, Galluzzi et al. 2010). Recentment, s’ha suggerit que la interacció entre RIP1 i RIP3 precedeix a una auotofosforilació de RIP3, que permet reclutar nous components al necrosoma com la quinasa MLKL (mixed lineage kinase domain-like protein) i la fosfatasa mitocondrial PGAM5 (Sun, Wang et al. 2012; Wang, Jiang et al. 2012). A més, en el laboratori de X. Wang, s’ha trobat un compost químic referit com a necrosulfamida (NSA), capaç d’inhibir la mort necroptòtica a nivell de la quinasa MLKL (Sun,

56

Wang et al. 2012). La quinasa reclutada al necrosoma es troba doblement fosforilada per RIP3, i totes dues fosforilacions es requereixen per l’execució de la mort necroptòtica (Sun, Wang et al. 2012). Pel que fa a la fosfatasa mitocondrial PGAM5, les seves dues isoformes (PGAML (long form) i PGAMS (short form)), també es recluten al complexe necrosòmic i es fosforilen a través de RIP3 (Wang, Jiang et al. 2012). L’estat actiu fosforilatiu de les dues isoformes en el complexe necrosòmic, permet activar per defosforilació el regulador de fissió mitocondrial Drp1 (dynamin- related protein 1), pel que s’acaba induint la fragmentació necroptòtica de la mitocòndria (Wang, Jiang et al. 2012) (Figura I32).

Figura I32. Model de necroptosi en el receptor de mort TNF. La lligació del receptor de mort TNF permet la

constitució el complexe I pel reclutament de TRADD, RIP1, TRAF2 i cIAP 1/2. L’estat ubiquitinat del complexe I s’associa a l’activació de la via de supervivència NF-kB a través del complexe LUBAC. La quinasa TAK1 per interacció amb RIP1 poliubiquitinat pot també inhibir la via de mort. A20 com a enzim editor de la ubiquitinació també actua com a regulador positiu pel manteniment de l’estat poliubiquitinat del complexe I. CYLD estimula la desubiquitinació del complexe per la generació del complexe IIb o necrosoma pel desencadenament de la senyal necroptòtica. El necrosoma es constitueix per FADD, caspasa-8 inactivada (en aquest cas per cFLIP o ZVAD), RIP1, RIP3, MLKL i PGAM5. Necrostatina inhibeix el complexe a nivell de RIP1 i NSA per MLKL. L’activació del necrosoma requereix RIP1 i RIP3 actives pel conseqüent reclutament i fosforilació de MLKL i PGAM5. La doble fosforilació de MLKL per RIP3 és seguida de la fosforilació de la isoforma PGAM5L. La isoforma PGAM5S és posteriorment també reclutada i fosforilada al complexe necrosòmic. L’estat actiu de les isoformes PGAM5 permet defosforilar Drp1 per la execució de la fissió mitocondrial (adaptat de (Zhou, Han et al. 2012)).

57

La implicació de totes aquestes molècules de senyalització en la mort necroptòtica, es realça amb la inhibició d’aquesta mort pel knockdown tant de RIP1, RIP3 com MLKL. El silenciament gènic, però, de qualsevol de les dues isoformes de PGAM5 o de Drp1, només aconsegueix atenuar la mort necroptòtica de TNF (Wang, Jiang et al. 2012). No obstant i de forma sorprenent, el silenciament gènic d’aquestes proteïnes també aconsegueix atenuar la mort necròtica induïda per estímuls intrínsecs com els ROS i la sobrecàrrega de calci. Els altres executors necroptòtics no poden, en canvi, evitar la mort d’aquest tipus d’estímuls necròtics (Wang, Jiang et al. 2012).

El densencadenament final de la necroptosi per sota de l’activació del complexe necrosòmic, s’associa principalment a esdeveniments cel·lulars com la depleció dràstica d’ATP, la sobreproducció de ROS o la sobrecàrrega de calci citosòlica, amb la conseqüent obertura del porus de transició de permeabilitat mitocondrial (Vanlangenakker, Vanden Berghe et al. 2008). No obstant, s’han identificat alguns mecanismes en l’execució final de la necroptosi per implicació directa de RIP1 i RIP3. RIP1 es suggereix en un possible mecanisme de senyalització resultant en la inhibició del translocador d’ATP ANT, pel que acaba contribuint a la depleció necròtica d’ATP (Temkin, Huang et al. 2006). Per altra banda, s’ha vist que RIP3 està implicat de forma directa en la sobreproducció de ROS per activació de varis enzims metabòlics, els qual desencadenen un estrès metabòlic mitocondrial i la conseqüent sobreproducció d’intermediaris oxidatius (Zhang, Shao et al. 2009) (Figura I33).

Figura I33. Execució necroptòtica de RIP3 en la sobreproducció de ROS. La mort necroptòtica és desencadenada pel

lligand de mort TNF amb la inactivació de caspases i presència de RIP3. RIP3 interacciona i activa els enzims metabòlics PYGL (glycogen phosphorylase) implicat en la degradació de glicogen per la obtenció de glucosa-1-fosfat, GLUL (glutamate-ammonia ligase) per la conversió de l’aminoàcid glutamat (Glu) a glutamina (Gln) i GLUD1 (glutamate dehydrogenase 1) per la obtenció del substracte energètic α-cetoglutarat al cicle de Krebs o d’àcids tricarboxílics (TCA). La sobrectivació del cicle es tradueix amb un increment d’activitat en la cadena de transport electrònic mitocondrial i conseqüent efecte de producció de ROS (modificat de (Zhang, Shao et al. 2009)).

La producció de ROS en la mort necroptòtica, però, únicament no està relacionada amb la mitocòndria. En concret, s’ha descrit una implicació de RIP1 en el reclutament de la NADPH oxidasa Nox1 a través de la quinasa rivoflavina (RFK), la qual actua de molècula pont entre el

58

receptor de mort TNFR1 i la subunitat comuna de les NADPH oxidases p22 phox (Kim, Morgan et al. 2007) (Kim, Morgan et al. 2007; Yazdanpanah, Wiegmann et al. 2009). De fet, s’ha suggerit que la producció del superòxid extracel·lular per Nox1, pot contribuir i afavorir la producció de ROS en la cadena respiratòria mitocondrial durant la mort necroptòtica (Morgan, Kim et al. 2008).

L’efecte cel·lular de ROS acaba induint la disfunció mitocondrial amb la conseqüent parada de síntesi d’ATP. La depleció de la molècula energètica, però, també es pot desencadenar en la mort necroptòtica a nivell de dany oxidatiu a l’ADN. L’enzim reparador d’ADN PARP1, en un excés d’activació resulta en un consum desmesurat del cofactor NAD+ i la conseqüent, disminució d’ATP (Los, Mozoluk et al. 2002). Al seu torn, també s’ha descrit que la sobreactivació de PARP1 en morts necròtiques pot desencadenar l’alliberament d’AIF de la mitocòndria (Yu, Wang et al. 2002; Moubarak, Yuste et al. 2007).

Altres efectes necroptòtics que deriven del dany cel·lular oxidatiu es tradueixen a nivell de desestabilització dels diferents tipus de membranes cel·lulars. La sobrecàrrega de calci citosòlica afavorida pels increments de permeabilitat cel·lular reticular, poden acabar contribuint també a la disfunció mitocondrial. En el procés de mort necroptòtic també es pot afavorir l’actuació de múltiples proteases com ara les calpaïnes, donat un excés de calci citosòlic o bé, les cathepsines, donada per una inducció de la permeabilització membranal dels lisosomes. A més, altres agents cel·lulars poden també contribuir en la desestabilització de les membranes cel·lulars durant el procés de necroptòtic com ara les fosfolipases, les esfingomielinases o de forma específica les calpaïnes en la membrana lisosomal (revisat en (Vandenabeele, Galluzzi et al. 2010)).