Typical components in an FDML setup

Los SNPs, son una clase de marcadores moleculares que se caracterizan por cambios que se presentan en un nucleótido que cambian la secuencia de ADN mediante eventos de substitución, inserción y/ó deleción (Figura 2.6). Estos SNPs se encuentran en regiones codificantes y no codificantes en el genoma (DeYoung y Honeycutt, 2005).

Figura 2.6. Esquematización de la ubicación de un SNP en una secuencia de ADN. Los SNPs son

cambios en una sola base (A, T, C ó G) de una secuencia original de ADN transformándola en una secuencia mutada. Estos cambios pueden o no cambiar la secuencia de aminoácidos que producen.

Existen varias técnicas moleculares utilizadas en la identificación de SNPs, entre las cuales se puede mencionar las siguientes:

2.14. 1. Discriminación alélica

Es un proceso basado en un ensayo fluorogénico de nucleasa 5´, el cual permite identificar el SNP utilizando dos sondas marcadas con fluoróforos diferentes; por ejemplo una sonda marcada con el fluoroforo VIC que identifica al alelo 1 ó el alelo sin la mutación. La otra sonda marcada con FAM, identifica al alelo 2 ó el alelo mutado. Ambas

señales de las sondas (VIC y FAM) indican la presencia de los dos alelos, es decir los genotipos heterocigotos para la característica (Livak et al., 1999); (Figura 2.7). Aunque es una técnica relativamente simple, rápida y reproducible, no obstante, es necesario contar con un equipo de PCR en tiempo real (Sifuentes et al., 2006).

Figura 2.7. Proceso de discriminación alélica (adaptado de Livak et al., 1999). Este proceso permite

identificar SNPs mediante la utilización de sondas alelo-específicas (FAM y VIC) marcadas con fluoróforos diferentes (reportero y quencher ó inhibidor). La actividad exonucleasa 5´ de la Taq-ADN polimerasa degrada las sondas que hibridan con la secuencia complementaria liberando al fluoróforo correspondiente (reportero) emitiendo una luz fluorescente.

2.14. 2. La técnica de PCR-RFLP

Los Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción asociada a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR-RFLP), permite generar fragmentos de ADN de una región específica, la cual es reconocida por enzimas de restricción que se unen y digieren el ADN, cortándolo en los sitios donde se encuentra la secuencia específica de nucleótidos reconocidos por las endonucleasas. Las enzimas de restricción utilizadas reconocen 4 (principalmente) ó 6 pb de longitud (Botsein et al, 1980); (Figura 2.8).

La PCR-RFLP es una herramienta versátil, rápida y de bajo costo en la detección de SNPs de genes asociados a características de producción, así como para evaluar variación genética entre y dentro de poblaciones (DeYoung y Honeycutt, 2005; Sifuentes et al., 2006).

Sin embargo, esta técnica tiene una limitante que en ciertas ocasiones no existen sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción, lo que impide la detección del SNP, por lo que es necesario utilizar otros métodos como la creación de sitios de restricción durante la amplificación (ACRS), para detectar el polimorfismo (Eiken et al., 1991; Nafa et al., 1996).

Figura 2.8. Proceso de digestión enzimática por RFLP. La digestión de un fragmento amplificado de

una secuencia de ADN, se realiza con una enzima de restricción que reconoce la secuencia específica (CCATG▼G), cortándola en diferentes fragmentos. Al existir un cambio nucleotídico en la secuencia (CCATGT), la enzima no reconoce el sitio y no corta el fragmento de ADN.

3. JUSTIFICACIÓN

La ganadería productora de carne tiene una gran importancia para el país y se desarrolla en más del 50% del territorio nacional. En México existen cerca de un millón de unidades de producción, que generan el 26% del valor económico pecuario (alrededor de 600 millones de dólares) además, de sostener más de 250 mil empleos remunerados (CNG, 2007). Sin embargo, a pesar de su importancia, esta ganadería productora de carne aún exhibe ciertas limitantes que restringen su autosuficiencia. Los grandes volúmenes de importación de productos y subproductos cárnicos, aunado a la dependencia de material genético, apoyan la necesidad de generar estrategias de mejora que involucren criterios genéticos.

El mejoramiento genético, como alternativa para obtener animales con mayor rendimiento de producción, ha sido propuesto como una medida que contribuya a incrementar la productividad y la eficiencia en los hatos ganaderos nacionales.

Actualmente, la genética molecular ha probado ser auxiliar en el mejoramiento genético, mediante la implementación de técnicas moleculares de diagnóstico que permitan la identificación temprana de individuos portadores de las variantes alélicas favorables para características de importancia económica y productiva.

A la fecha los marcadores TG5, 316, 4751 (CAPN1) y Q204X, han sido evaluados en diferentes poblaciones de bovinos, los resultados de su asociación a características de calidad de la carne los hacen candidatos ideales para su evaluación en hatos de México, y determinar su aplicabilidad en las estrategias de mejoramiento en las razas explotadas en el país.

4. OBJETIVO GENERAL

Determinar la frecuencia y efecto fenotípico de variantes alélicas de genes asociados a calidad de carne en bovinos de la raza Charolais.

4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1) Implementar la técnica PCR-RFLP como alternativa para la identificación de variantes SNPs de marcadores asociados a calidad de la carne.

2) Estimar las frecuencias genotípicas y alélicas de TG5 del gen de Tiroglobulina. 3) Estimar las frecuencias genotípicas y alélicas de los marcadores 316 y 4751 del gen

de Calpaína 1 (CAPN1).

4) Estimar las frecuencias genotípicas y alélicas de la variante Q204X en animales de raza Charolais.

5) Estimar el efecto de los genotipos de TG5, 316, 4751 y Q204X, sobre algunas características fenotípicas en animales de la raza Charolais.

5. HIPÓTESIS

Las variantes alélicas de los genes asociados a calidad de carne se encuentran en equilibrio genético y tienen un efecto significativo sobre algunas características fenotípicas en ganado Charolais.

6. MATERIALES Y MÉTODOS

El presente estudio se dividió metodológicamente en tres etapas: 1) Origen del material biológico, y pruebas de comportamiento, 2) Optimización y genotipificación de las poblaciones con cuatro marcadores moleculares asociados a características de calidad y, 3) Análisis de asociación.