El personal de salud deberá manipular las muestras conservando prácticas de bioseguridad de nivel BSL-2. Todos los procedimientos de manipulación de la muestra se debe realizar bajo cabina de seguridad biológica clase II (CSB-II). Ante la sospecha por virus con potencial epidémico se debe reforzar las medidas de bioseguridad, el uso de elementos de protección personal y si se requiere, el uso de equipo de respiración autónoma PAPR (Powered Air PurifyingRespirator).
Toda muestra debe remitirse con la ficha epidemiológica del evento completamente diligenciada, acorde al Protocolo de Vigilancia de IRA en Salud Pública. El INS podría no procesar muestras con fichas parcialmente diligenciadas.
En los casos de Enfermedad Similar a Influenza – ESI y/o casos de Infección Respiratoria Aguda Grave –IRAG: se debe realizar la recolección del 100% de las muestras respiratorias únicamente en las UPGD seleccionadas para la vigilancia centinela en los departamentos priorizados. Estas muestras serán procesadas para diagnóstico de Influenza y otros virus respiratorios por la técnica de inmunofluorescencia y/o rRT-PCR en los respectivos laboratorios departamentales o distritales de salud pública (LDSP), cumpliendo con las indicaciones en cuanto a recolección, conservación y transporte de muestras establecidas a nivel nacional. Las muestras referenciadas en este numeral NO serán procesadas por el INS.
radiológicos u otros exámenes clínicos, deben ser confirmados o descartados por el laboratorio mediante cultivo para identificación de agentes bacterianos en el nivel local.
En todos los casos de muerte por IRA en menores de cinco años y muerte por IRAG inusitado que se presenten en todas las entidades territoriales, así como las muertes por IRAG en las UPGD centinela se deberá realizar diagnóstico molecular de virus respiratorios, Streptococcuspneumoniae y Haemophilusinfluenzae en muestras respiratorias o de tejidos en el Laboratorio de Salud Pública con capacidad diagnóstica, o en el Laboratorio Nacional de Referencia INS.
Se recomiendan cortes de tejido del tracto respiratorio que deben ser conservados en solución salina refrigerados para análisis virológico y microbiológico con contra muestra en formol tamponado al 10 %, las muestras deben ir acompañadas de la ficha de notificación y la historia clínica, se deben enviar al INS. El INS podría no procesar muestras con fichas parcialmente diligenciadas.
Si se sospecha de un caso de IRAG inusitado, se debe recolectar muestra (aspirado nasofaríngeo) y enviar al INS para su debido análisis virológico, adicionalmente recolectar muestras de sangre (hemocultivos) o líquido pleural para diagnósticos bacteriano (Streptococcuspneumoniae y Haemophilusinfluenzae). El INS NO procesará muestras que no cumplan con la definición de caso de IRAG inusitado
Los LDSP que han sido capacitados para realizar el diagnóstico de Influenza y otros Virus Respiratorios por la técnica de Inmunofluorescencia (IFI), deberán procesar las muestras de casos captados en la vigilancia centinela de ESI-IRAG, y remitir mensualmente la información de las muestras procesadas y el control de calidad indirecto al INS.
La prueba de inmunofluorescencia en la actualidad se realiza para la vigilancia de influenza y en especial de otros virus respiratorios causantes de IRA, no es la prueba confirmatoria para el diagnóstico del virus de influenza A(H1N1)pdm09 ni de otros subtipos de influenza A, debido a la generación de falsos negativos como resultados por su baja sensibilidad en la identificación. Por lo anterior, se debe remitir de inmediato las muestras con resultado positivo para influenza tipo A por IFI al LSPD capacitado para PCR o al INS, con el fin de realizar la debida subtipificación del virus de Influenza tipo A.
Los LDSP con capacidad de realizar diagnóstico molecular de Influenza A, mediante la técnica de PCR en tiempo real (rRT-PCR), deberán procesar las muestras de los casos de IRAG y remitir al INS las muestras con resultado positivo para Influenza A que no se puedan subtipificar, es decir, que no correspondan A(H1N1) pdm09, con el fin identificar otro subtipo del virus de influenza.
Todas las entidades territoriales que participan en la vigilancia de ESI-IRAG e IRAG inusitado deberán garantizar la sostenibilidad de la vigilancia.
Para los casos de IRAG inusitado o mortalidades: se debe realizar rRT-PCR para influenza tipo A y B, así como el diferencial con otros virus respiratorios, esto se llevará a cabo en el laboratorio de Virología del INS, el cual actúa como laboratorio de referencia nacional y centro colaborador de la red mundial de influenza de OMS.
El INS se reserva el derecho de no procesar muestras en los siguientes casos: A) Muestras que no cumplan con las definiciones de caso establecidas en el protocolo nacional. B) Muestras procedentes de LDSP con capacidad diagnóstica (a excepción de casos fatales o IRAG inusitado). C) Muestras inadecuadas (mal embaladas, muestras no aptas para proceso, muestras mal conservadas o con deficiente diligenciamiento de la ficha). D) Muestras que excedan los porcentajes estipulados para cada LDSP.
Las muestras de secreciones respiratorias se deben colocar en medio de transporte viral, ser rotuladas (nombre(s) y apellido(s), tipo de muestra y fecha de recolección), y refrigeradas de inmediato hasta su procesamiento para garantizar la viabilidad viral.
7.3.2. Recolección, conservación y transporte de muestras 7.3.2.1 Laboratorio de Virología
Para el diagnóstico viral se deben tener en cuenta alguna de las siguientes muestras como son:
- Hisopado/frotis faríngeo - Aspirado nasofaríngeo - Lavado nasal, broncoalveolar
- Tejidos post- mortem (Biopsia de pulmón, tráquea, bronquio, etc)
Para la obtención de un diagnóstico virológico acertado, es indispensable la selección adecuada del caso (ESI/IRAG o IRAG inusitado) y la recolección adecuada de la muestra (dentro de los 7 a 10 primeros días de inicio de síntomas), de lo contrario muestras con más días después de inicio de síntomas, no serán procesadas por el Laboratorio de Virología del INS, al igual que el LSPD no debe procesar estas muestras. Las muestras deben ser recolectadas en medio de transporte de viral (MTV) mínimo en un volumen de 1,5ml y no en solución salina cuando se trate de un hisopado faríngeo. Muestras que se reciban así en el INS no serán procesadas. Por el contrario muestras que correspondan a aspirados nasofaríngeos, estas deben ser recolectadas en mínimo 3ml de solución salina estéril, el aspirado puede ser recolectado con sonda nasofaríngea o con trampa, de acuerdo al procedimiento que cada hospital lleva a cabo.
poliéster (nunca utilizar hisopos con mango de madera puesto que inhiben el virus, ni emplear hisopos de alginato de calcio porque alteran la calidad de la muestra), y se debe realizar un frotis rotando dos hisopos en la parte posterior de la garganta contra la pared de la laringe evitando tocas las amígdalas
Las muestras de lavado broncoalveolar o aspirado bronquial también son útiles en el diagnóstico por enfermedad respiratoria en pacientes hospitalizados previa autorización e indicación médica.
En los casos de mortalidad por IRA en menores de cinco años o muerte por IRAG inusitado, con sospecha de muerte por virus de influenza u otro virus al cual no se le recolectó muestra respiratoria en vida, se debe realizar aspirado nasofaríngeo hasta seis horas posteriores a la muerte, y cortes de tejido de aproximadamente 3 x 3 cm de pulmón y bronquios (de ambos lados (derecho e izquierdo) ), glotis, orofaringe y tráquea en solución salina, refrigerados (entre 2 a 8°C) para análisis virológico con contra muestra adicional de los mismos tejidos en formol tamponado al 10 % para estudio histopatológico.
Las muestras de tejidos deben remitirse en frascos estériles de cierre hermético e individuales, rotulados con nombres y apellidos, tipo de tejido y fecha de obtención del tejido y con carta de remisión separadas para cada laboratorio (patología, virología y microbiología)
Las muestras de hisopados faríngeos deben ser recolectadas en medio de transporte de viral (MTV) mínimo en un volumen de 1,5ml y se les debe dejar el escobillón dentro del MTV, para que el profesional entrenado en los LSP o en el INS con capacidad de proceso sean los responsables de retirar este escobillón y así continuar con el debido procedimiento de IFI o de PCR; muestras que envíen como muestras de hisopados en solución salina no serán procedas por el INS o por el LSP.
Por el contrario muestras que correspondan a aspirados nasofaríngeos, estas deben ser recolectadas en mínimo 3ml de solución salina estéril, el aspirado puede ser recolectado con sonda nasofaríngea o con trampa, de acuerdo al procedimiento que cada hospital que lleva a cabo. Es decisión de la UPGD dejar o no la sonda dentro de la solución salina (3ml), siempre y cuando que si deciden retirarla deben garantizar el debido escurrimiento del contenido de la sonda en los 3ml de solución salina, esto con el fin de evitar la pérdida de la partícula viral y evitar muestras inadecuadas o falsos negativos. Muestras que lleguen con volumen insuficiente no serán procesadas por el INS
Cada caso debe remitirse con copia de la ficha epidemiológica y de la epicrisis, todo tipo de muestra debe ser remitida al laboratorio de salud pública como conducto regular, con el propósito de mejorar el flujo de la información.
degradación viral. Si las muestras van a hacer procesadas o enviadas al INS o al LSPD dentro de las primeras 48 horas luego de su recolección, se deben conservar a una temperatura de refrigeración es decir entre 2 a 8°C, sino es así, es decir si van a ser procesadas o enviadas al LSDP o al INS después de las 48 horas se deben conservar congeladas (-70°C). El transporte de las muestras debe realizarse con geles refrigerantes o pilas congeladas, El transporte de las muestras debe realizarse con pilas congeladas, en el momento del envío, ya que temperaturas superiores a 8°C degradan la partícula viral, obteniéndose falsos negativos Muestras que lleguen al INS con temperaturas fuera del rango de 2 a8°C , no serán procesadas.
Teniendo el nivel de bioseguridad necesario para el manejo de las muestras respiratorias y para evitar contaminaciones, derrames y lograr recuperación ideal de la muestra y lograr así una excelente calidad de resultado, el personal encargado de la recolección de las muestras en las UPGD y de los laboratorios que no cuentan con capacidad diagnostica ya sea de IFI o PCR no deben retirar los escobillones de la muestra de hisopados, ya que estas no cuentan con cabina de bioseguridad y posiblemente la manipulación de las muestras está ocasionando una perdida en la recuperación de los agentes virales, y pueden ocasionar infecciones por algún agente respiratorio al personal de las UPGD.
7.3.2.2. Laboratorio de Microbiología
Recolección de muestras para cultivo
Las indicaciones para obtener cultivos representativos de sangre o líquido pleural, están relacionadas con las condiciones clínicas del paciente. Si el paciente ha recibido algún antimicrobiano antes de la recolección de la muestra de sangre, deben tomar un total de dos muestras separadamente en un tiempo no mayor de 48 horas.
El objetivo es identificar los microorganismos responsables de IRAG o IRAG inusitado para poder plantear un tratamiento dirigido y evitar el uso inadecuado de antimicrobianos.
Las condiciones en la recolección de la muestra de sangre o líquido pleural deben ser asépticas, limpiando primero la zona de la piel con agua y jabón, alcohol de 75%, y aplicando una solución de yodo al 2 % en forma concéntrica de adentro hacia fuera, alrededor del sitio de la punción. Esta solución deberá permanecer sobre la piel al menos un minuto para que ocurra una verdadera antisepsia. No deberá tocarse la superficie de la piel con los dedos.
Las muestras de sangre para hemocultivo deben ser procesadas para el diagnóstico de
gérmenes comunes (Streptococcuspneumoniae, Haemophilus influenza,
Moraxellacatarralis, Staphylococcusaureus, Klebsiellapneumoniae y Pseudomonaaeruginosa). Deben ser sembradas en Agar Sangre, Agar Chocolate, Agar MacConkey.
En un caso mortalidad por IRA en menores de cinco años o muerte por IRAG inusitado, causada por agentes bacterianos, se debe tomar cortes de tejido de aproximadamente dos por tres centímetros de pulmón y bronquios (de ambos lados), glotis, orofaringe y tráquea en solución salina, refrigerados para análisis microbiológico con contra muestra adicional de las mismos tejidos en formol tamponado al 10 % para estudio histopatológico. Se debe tener en cuenta que la misma muestra se utiliza para la búsqueda de virus y bacterias.
Conservación y envío de aislamientos
Una vez confirmado en el LSPD, remitir en medio de transporte AMIES a temperatura ambiente al Grupo de Microbiología del INS para identificación y patrones de susceptibilidad antimicrobiana.
Todas las muestras remitidas al INS para el estudio de agentes respiratorios, deben ser transportadas teniendo en cuenta la normatividad vigente para el transporte de muestras por vía aérea y terrestre en condiciones óptimas de bioseguridad, mediante el sistema de embalaje triple.
Documentación asociada a la vigilancia del evento
Las muestras para estudio virológico deben ser enviadas con una carta de solicitud que debe incluir: Nombre del grupo al cual se remite la muestra o del referente por laboratorio del evento, nombre del paciente, fecha de envío de la muestra, tipo de muestra y procedimiento realizado, procedencia (nombre de la institución remitente con dirección, teléfono, fax y correo electrónico), además de la respectiva Ficha epidemiológica de notificación del evento vigente.
Los aislamientos bacterianos deben ir acompañáramos del formato de envío de aislamientos FOR-R01.5030-001 para Streptococcuspneumoniae, y FOR-R01.5030-002 de Haemophilusinfluenzae, los cuales deben estar diligenciados en su totalidad con letra legible. En casos de mortalidad por IRAG, las muestras deben estar siempre acompañadas con la Ficha epidemiológica de notificación del evento vigente.
7.4. Ensayos de laboratorio asociados a la vigilancia del evento 7.4.1. Laboratorio de Virología
A todos los casos de Enfermedad Similar a Influenza – ESI: serán procesados por la técnica de inmunofluorescencia (IFI), las cuales debe estar estén dentro de los 7 primeros días de inicio de síntomas, de lo contrario serán procesados por rRT-PCR en los laboratorios que cuenten con capacidad diagnostica y si no deberán ser enviadas al INS
disminuye después de los 7 días de inicio de síntomas, razón por la cual posiblemente se obtienen muchos falsos negativos.
La prueba de inmunofluorescencia en la actualidad se realiza para la vigilancia de influenza y en especial de otros virus respiratorios causantes de IRA, no es la prueba confirmatoria para el diagnóstico del virus A (H1N1) pdm 09 ni de otros subtipos de influenza A, debido a la generación de falsos negativos como resultados por su baja sensibilidad en la identificación. Por lo anterior, se debe remitir de inmediato las muestras con resultado positivo para influenza tipo A y B por IFI al LSPD capacitado para PCR o al INS, con el fin de realizar la debida subtipificación del virus de Influenza tipo A y confirmación de influenza B
Los casos con Infección Respiratoria Aguda Grave –IRAG: Los LSPD que realizan IFI únicamente, procesaran las muestras que estén de los 7 primeros días de lo contrario serán remitidas al INS para su respectivo procesamiento. Los LSPD que cuentan con capacidad diagnostica de rRT-PCR deberán procesar el 100 % de las muestras de IRAG por esta técnica molecular para influenza inicialmente y de acuerdo al resultado, realizaran PCR para los otros virus respiratorios o IFI para otros virus respiratorios esto depende de la capacidad diagnostica del LSP (es decir si se obtiene un resultado negativo para influenza se le deberá procesar los toros virus respiratorios). Adicionalmente, las muestras con resultado positivo para Influenza A que no se puedan subtipificar, es decir, que no correspondan A(H1N1) pdm09, con el fin identificar otro subtipo del virus de influenza.
Los laboratorios de salud pública que cuentan con capacidad diagnostica de IFI o PCR es decir que manipulan muestras respiratorias ya sean de hisopado o aspirado deben tener en cuenta lo siguiente:
1. Realizar vórtex mínimo por un minuto antes de retirar el escobillón, en el caso de hisopados.
2. Escurrir muy bien el escobillón y mezclar la muestra para garantizar la homogenización.
3. En el caso de los aspirados nasofaríngeos realizar vórtex al aspirado mínimo por un minuto.
4. Agregar el aspirado al tubo del medio de transporte (MTV) aproximadamente entre 500μl a 1ml, de acuerdo al tubo del MTV y al volumen del mismo. No agregar el MTV al aspirado ya que este se diluye y no hay una protección de la partícula viral, ocasionando falsos negativos.
INS (el día jueves) el formato de consolidado de procesamiento por semana epidemiológica.
7.4.2. Laboratorio de Microbiología
En el laboratorio de Microbiología se realizaran las siguientes pruebas:
• Prueba de solubilidad en bilis • Prueba de optoquina
• Serotipificación
• Pruebas de sensibilidad antimicrobiana de los aislamientos enviados
7.5. Control de calidad
Se realizan dos tipos de supervisiones Evaluación externa del desempeño indirecta – EEDI y Evaluación externa del desempeño directa – EEDD
7.5.1. Ensayos realizados en el Laboratorio de Virología Evaluación externa del desempeño indirecta – EEDI
Los laboratorios que realizan el diagnóstico por la técnica de Inmunofluorescencia indirecta para la identificación de virus respiratorios, y el diagnóstico por la técnica de RT-PCR para la identificación de virus Influenza A y otros virus respiratorios, deben remitir la primera semana de cada mes al Laboratorio Nacional de Referencia INS, el control de calidad indirecto y envío en medio electrónico del consolidado de las muestras procesadas en los formatos establecidos.
La Evaluación externa del desempeño indirecta está indicada así:
Ensayo de Inmunofluorescencia:
Envío mensual al INS del 100 % de láminas de casos positivos, y el 10 % de láminas de casos negativos. Envío mensual al INS del 100 % las muestras positivas (alícuota de muestra original con un volumen mínimo aceptable es 600uL) correspondiente a los casos positivos con sus respectivas fichas epidemiológicas, en el formato de control de calidad establecido por el INS
Ensayo de PCR:
Envío mensual del 100 % de muestras positivas para virus respiratorios y el 10 % de muestras negativas. La muestra a enviar corresponde al extracto de RNA/DNA tanto para las muestras positivas como para las negativas; así como también enviar al INS
respectiva ficha de notificación y del formato respectivo para envío del control de calidad
NOTA: El INS podría no procesar las muestras que excedan los porcentajes estipulados en el presente numeral.
Para la evaluación externa del desempeño directa – EEDD
Se evalúa una vez al año el desempeño de los Laboratorios de Salud Pública participantes en cuanto a la detección del virus de la Influenza A y otros Virus Respiratorios, mediante la técnica de RT–PCR. Se remiten 10 muestras biológicas liofilizadas.
7.5.2. Ensayos realizados en el Laboratorio de Microbiología
Para la evaluación externa del desempeño indirecta – EEDI los Laboratorios de Salud Pública deben remitir al INS el 100 % del total de los aislamientos de las muestras
positivas y sospechosas procesadas de Streptococcuspneumoniae y
Haemophilusinfluenzae.
Para la evaluación externa del desempeño directa – EEDD
El Grupo de Microbiología del INS, participa en la Evaluación Externa del Desempeño EED, realizada por el CDC.
A nivel nacional se evalúa el desempeño de los LSPD y respectiva red, mediante la prueba de idoneidad en microbiología Clínica (PIMC). Se envían tres cepas liofilizadas cuatro veces al año.
7.6. Responsabilidades de los Laboratorios en la vigilancia del evento 7.6.1. Vigilancia Virológica (ver flujograma)
Prestador (UPGD): Las UPGD centinelas seleccionadas para la vigilancia de ESI e IRAG respectivamente, son responsables de recolectar muestras de manera semanal, captar correctamente el caso de ESI-/IRAG, IRAG inusitado y muertes por IRA en menores de cinco años.
Embalar correctamente las muestras y anexar toda la documentación requerida para el envío de las mismas.
Laboratorio de Salud Publica Departamental (LSPD): Garantizar la vigilancia de IRA en su departamento, corroborar que las muestras estén correctamente embaladas para su envió