You have this utopia of how a woman should be.

Con el presente trabajo hemos creado un modelo de piel humana sobre ratón NOD/Scid caracterizado por viabilidad y mantenimiento a largo plazo de dicha piel, y de dimensiones mayores a otros modelos publicados hasta el momento.

Uno de los problemas más importantes para responder a preguntas científicas en el campo de la Medicina es el poder disponer de modelos experimentales sobre los que testar nuevas medidas y acciones terapéuticas destinadas a la mejora de la calidad de vida de los pacientes.

Los modelos in vitro son rápidos de obtener y sencillos, y mínimas consideraciones éticas están implicadas en su uso, sobre todo si se compara con modelos in vivo. Además, los sistemas vivos poseen una complejidad muy elevada, por lo que las carencias que presentan los modelos in vitro hacen que estos últimos se usen en estudios preliminares.

Como ya hemos comentado en el apartado 1.5 de la introducción, los modelos animales son una alternativa fundamental en la investigación, dado que las consideraciones éticas y prácticas hacen que los estudios en humanos sean limitados. Modelos animales de pequeño tamaño, manejables y poco costosos, se han convertido en importantes herramientas de investigación; y en el ámbito de cicatrización de heridas cutáneas los modelos murinos han alcanzado una gran

relevancia.126

En un primer momento, utilizamos para nuestro estudio ratones atímicos ‘nude’. No obstante, en nuestra experiencia el injerto de piel humana fue rechazado en todos los casos. Tras la cirugía, la piel humana fue transformándose progresivamente en una escara dura y oscura, que abarcó la totalidad del injerto en 3 semanas (como se puede ver en la Figura 5). El análisis histológico mostró un infiltrado inflamatorio en la dermis, con zonas de edema y desprendimiento de la piel humana con respecto al plano subcutáneo del ratón, compatible con rechazo del injerto.

El trasplante de piel humana sobre modelos animales ha sido un objetivo difícil de conseguir, dado que se trata de un órgano extremadamente exigente en términos de histocompatibilidad. Por ello, es fundamental el estado inmunológico del receptor. El ratón ‘nude’,

una cepa sin pelo descrita por Flanagan172 _{en 1966, y que carece de células T, fue el primer animal}

de laboratorio con condiciones prometedoras para el trasplante de piel. Demarchez et al.179

demostró con sus estudios que la piel humana injertada en el ratón ‘nude’ parecía no solo ser capaz de preservar la identidad estructural, inmunológica, y la distribución de sus marcadores específicos, sino también algunas de sus propiedades funcionales. Así, numerosos autores lo utilizaron en sus

experimentos.176-179,183,212 _{Dado que nuestros resultados fueron totalmente opuestos a los}

publicados, nos planteamos dos preguntas: ¿Por qué había rechazo de la piel si el ratón era inmunodeprimido, especialmente cuando varios artículos habían demostrado su utilidad para este tipo de trasplantes?; ¿Existía otro tipo de ratón más inmunodeprimido que nos permitiera realizar la cirugía con éxito?.

Revisando la literatura podemos encontrar que, aunque varios autores han publicado resultados exitosos de piel humana en ratones ‘nude’ (como ya hemos señalado anteriormente), en algunos experimentos se han producido resultados poco satisfactorios, con rechazo del xenoinjerto,

o desarrollo de una cicatriz hipertrófica en lugar de piel humana normal viable.184,185,199 _{Yang et}

al184 _{encontraron, de manera accidental, que injertos de piel humana sobre ratones ‘nude’}

desarrollaban cicatrices hipertróficas locales. Observaron un proceso similar a la reacción de rechazo contra trasplante: en las primeras semanas tras la cirugía la epidermis y porciones superiores de la dermis de los injertos se endurecían desde los bordes hacia el centro, cambiando de color rojo a negro, para finalmente desprenderse de manera gradual, mostrando una cicatriz hipertrófica. Los autores postularon que, a pesar de la inmunosupresión de los ratones que evita el rechazo tisular, otros mecanismos podían estar implicados, desde la propia antigenicidad del tejido donante, la presencia de células T extratímicas, o bien el papel de macrófagos y células natural-

killer. En esta línea, Lin et al.259 _{publicaron que las células NK y los macrófagos (cuya actividad}

está incrementada en cepas nude), pueden ser activados en ausencia de células T o de xenoanticuerpos y directamente rechazar los xenoinjertos. Por otro lado, se sabe que la dermis tiene menor capacidad que la epidermis para estimular rechazo inmune, lo cual justificaría por qué se

produce descamación de la epidermis y dermis superficial pero no de la dermis profunda.155,260,261

Por su parte, Wang et al.185 _{corroboraron los resultados de Yang injertando piel humana en el dorso}

del trasplante. Demostraron incremento en los acúmulos de fibrillas de colágeno en dermis, y aumento del infiltrado de macrófagos, mastocitos y fibrocitos.

A la pregunta de si existía otro tipo de ratón más inmunodeprimido que nos permitiera realizar la cirugía con éxito, la respuesta es sí. En los años 90 se empezó a consolidar el modelo de

ratón SCID como receptor de piel humana186-192_{, y en la última década numerosas investigaciones}

en piel humana se han realizado en este tipo de ratón.195-197,199-202 _{Zone et al.}199 _{establecieron un}

modelo animal de dermatosis IgA lineal con ratones SCID a los que injertaron piel humana y administraron anticuerpos específicos. Al inicio de sus experimentos, trasplantaron piel humana a ratones ‘nude’. No obstante, el desarrollo de inflamación y vesiculación espontánea en la zona de membrana basal en animales ‘nude’ control fue de gran preocupación para los autores. El análisis de estos injertos reveló que hasta un cuarto de los ratones demostraron depósito de IgM espontáneo, indicando una respuesta inmune en algunos de los ratones presumiblemente inmunodeprimidos. Por ello, decidieron cambiar el modelo a ratones SCID. Se avanza un paso más cuando se combinan defectos en la función inmunológica adaptativa y no adaptativa, como es el caso de las cepas NOD/ Scid. Entre sus numerosos defectos, incluyen disfunción de células NK, producción baja de citoquinas, macrófagos y granulocitos reducidos en función y número, ausencia de complemento

circulante y ausencia de células B y T maduras.175 _{Con todas estas características, decidimos usar}

este tipo de ratón como modelo receptor del injerto de piel humana.

Nuestros resultados con la cepa NOD.CB17-Prkdscid/NCrHsd (NOD/Scid) mostraron en todos los casos supervivencia del fragmento de piel implantado, sin objetivar rechazo. Obtuvimos una piel humana viable y estable, que conservó sus características macroscópicas y microscópicas durante 220 días. Los estudios histopatológicos evidenciaron conservación de las características estructurales de piel humana: presencia de un epitelio poliestratatificado queratinizado, dermis papilar y reticular con tejido conjuntivo denso, y presencia de vasos sanguíneos bien definidos y permeables, garantizando el aporte de oxígeno y nutrientes a la piel trasplantada. No se apreciaron acúmulos específicos de células inmunes ni inflamatorias, como cabía esperar al utilizar un modelo inmunodeprimido. Fue destacable la integridad de la membrana basal. Un hecho significativo y que denotó el buen comportamiento del injerto fue la ausencia espongiosis, acantólisis, y zonas de edema entre la epidermis y la dermis, presentes en las reacciones de rechazo cutáneo humano.

152,198,211,262-264 _{Como describieron inicialmente Medawar y otros autores}155,157_{, los elementos}

de células inflamatorias. Un mecanismo añadido de rechazo sería por oclusión vascular e isquemia tisular. Las células endoteliales de la microvasculatura de los injertos serían una diana de la respuesta inmune, y el rechazo podría ser atribuido, por tanto, a isquemia tisular resultante del daño

vascular extenso.198,262,263

Cuando se injerta un fragmento de piel, éste debe adquirir aporte sanguíneo para su supervivencia e integración con el tejido receptor. Este proceso se denomina revascularización, finaliza en torno al quinto o sexto día después del trasplante, y es de vital importancia para el éxito del prendimiento del injerto. Un fallo en la revascularización conllevaría una necrosis rápida, con

desprendimiento completo de la epidermis y la dermis a los pocos días de la cirugía.148,149,153,262,265

El mantenimiento de la piel, con sus características macroscópicas y coloración apropiada, hasta 25 días después de la cirugía (como se ve en la Figura 6), indica que en nuestro modelo el proceso de revascularización se produjo de manera exitosa. Es cierto que el injerto evolucionó hacia la formación de una costra a los 30 días, que posteriormente se desprendió, dando paso a una piel humana normal. Estos resultados coinciden con la costra superficial que también se aprecia en la evolución normal de los autoinjertos cutáneos realizados en el ser humano, y que concordaría con una necrosis parcial de las capas más superficiales. Además, podemos correlacionar dicha costra con el proceso de renovación de la epidermis. En humanos, el tránsito normal de una célula basal desde la capa basal hasta el estrato córneo es de al menos 14 días. El tránsito a través del estrato

córneo hasta la descamación requiere otros 14 días.266 _{El epitelio escamoso queratinizado}

experimenta un constante recambio celular, regenerándose por completo cada 48 días.267 _{En nuestro}

modelo la costra formada se desprendió por completo entre los 60 y 90 días. A la luz de estos datos podemos decir que el proceso de renovación celular no comienza inmediatamente tras el prendimiento de la piel.

Nos llamó la atención la hiperpigmentación de los injertos de piel humana tras el desprendimiento de la costra. No pudimos comprobar un patrón claro de hiperpigmentación, ya que no fue homogénea ni igual para todos los ratones. En unos casos se apreció un incremento de la pigmentación generalizada, y en otros casos se produjo a modo de manchas melánicas localizadas. No podemos explicar a qué se deben esas diferencias entre unos y otros. En todos los casos se seleccionó piel donante que a simple vista carecía de nevus u otras lesiones pigmentadas. Sí se comprobó que los ratones que recibieron piel del mismo donante se pigmentaron siguiendo el mismo patrón; es decir, de manera general o a modo de lesiones delimitadas. No obstante, la

hiperpigmentación de un injerto de piel no es un hecho exclusivo de nuestro modelo. En la práctica clínica es frecuente que los injertos cutáneos se pigmenten después del trasplante. Ocurre en pacientes caucásicos, negros o asiáticos, aunque es más pronunciado en pacientes de color, y están

implicados fenómenos de alteración de la unidad melanoepidérmica.268,269 _{Gilhar et al.}270

describieron una hiperpigmentación llamativa a las 4-6 semanas posteriores al trasplante de piel humana en ratones nude. Utilizaron injertos de piel parcial obtenidos de 18 donantes jóvenes y mayores. Todos ellos mostraron hiperpigmentación a las 4 semanas de la cirugía, salvo uno que lo mostró a las 5-6 semanas. El análisis histológico mostró aumento significativo del número de melanocitos en siete de nueve injertos de piel obtenidos de donantes ancianos, y en seis de seis injertos obtenidos de jóvenes; además de depósito prominente de gránulos de melanina en epidermis y dermis. Los autores concluyeron que el número de melanocitos tras un trasplante en ratón nude aumenta al igual que ocurre con la piel expuesta a radiación ultravioleta; aunque no pudieron determinar si el aumento de melanocitos se debía a proliferación celular, activación, o una combinación de ambos efectos.

Histológicamente podemos afirmar que nuestro modelo permite obtener piel humana estable con todas sus capas epidérmicas y dérmicas. El análisis inmunohistoquímico de las proteínas fibrilares de matriz extracelular mostró que la dermis reaccionó con formación y remodelación de proteínas fibrilares (elastina) hacia la región superficial - papilar, revelando un papel de soporte y estabilización de la epidermis. No obstante, nos planteamos si la naturaleza de las células constituyentes del injerto eran realmente humanas. Para corroborarlo, aprovechamos la condición de que el modelo se realizó sobre ratones macho (cromosomas XY), y la piel humana injertada procedía de donantes mujeres (cromosomas XX). La técnica citogenética de hibridación in situ fluorescente (FISH) permite el marcaje de secuencias de DNA específicas en los cromosomas, así como marcaje de cromosomas completos, y detección de anomalías cromosómicas, entre otras

muchas aplicaciones.271 _{La detección de cromosomas sexuales mediante la técnica FISH, utilizando}

sondas fluorescentes específicas para cromosomas X e Y, permitió demostrar la presencia de células

femeninas (XX), y por tanto humanas, en el injerto de piel. Otros autores, como Young et al.151 _han

utilizado esta técnica para diferenciar células endoteliales de ratón y humanas en xenoinjertos cutáneos sobre ratón atímico.

Del total de los 40 ratones NOD/Scid injertados, ocho murieron en la fase de desarrollo del modelo de injerto de piel humana. Seis de los ocho (75%) pertenecieron a la misma remesa

entregada por el laboratorio donde adquirimos los ratones. De esa remesa de seis ratones, tres murieron en el periodo de cuarentena, y otros tres en la cirugía o postoperatorio inmediato. Probablemente la muerte de esos ratones pertenecientes al mismo grupo estaría justificado por una enfermedad o patología ya presente al tiempo de entrada en el animalario, siendo un problema intrínseco e independiente de la técnica quirúrgica. Aunque se trata de una cepa frágil debido a su inmunosupresión, sólo dos ratones entre el resto de animales falleció en el postoperatorio del trasplante de piel, y uno tras la creación de la úlcera.

- Contracción del injerto

Uno de los fenómenos observados en nuestro modelo fue la contracción del injerto. El proceso de contracción primaria es la disminución del tamaño del injerto obtenido en fresco, como resultado de la presencia de elastina en la dermis. Cuanto más dermis tiene el injerto, mayor es la contracción primaria. Por tanto, el grosor del injerto determina el grado de retracción. La contracción secundaria es la consecuencia de la actividad miofibroblástica que tiene lugar en el

proceso de cicatrización final, y puede durar meses.148 _{En nuestro modelo, las dimensiones iniciales}

de la piel fueron de 12 cm2_{. La evolución del injerto fue hacia la formación inicial de una costra en}

los 30 primeros días, que posteriormente se desprendió, dando paso a la piel humana estable. Durante este tiempo, el injerto sufrió un proceso progresivo de contracción, siendo la tasa de contracción mayor en dos momentos: durante los primeros 7 días, y a partir de los 30 días tras la cirugía. El tamaño final del injerto se redujo hasta un 71% del tamaño original tras 120 días. Pensamos que parte de esta reducción se explicaría por un fenómeno de cicatrización del injerto, necesario para su adhesión al lecho receptor. Heridas cubiertas con injertos de piel pueden sufrir contracción que conduzca a cicatrices retráctiles. Tras la fase de inflamación aguda, los fibroblastos se activan y repueblan la zona entre el injerto y el lecho de la herida, produciendo colágeno que reemplaza la fibrina y ancla el injerto al lecho receptor. Durante este proceso, y mientras se establecen interacciones con la matriz extracelular para determinar la resistencia mecánica de las nuevas fibras, los fibroblastos pueden desarrollar fibras alfa-SMA (smooth muscle actin) y

transformarse en miofibroblastos, los cuales inducen la contracción.273 _{Es interesante observar}

cómo ratones que fueron injertados con la misma piel donante experimentaron diferente grado de contracción. Esto hace suponer que no sólo las características del injerto, si no también las características del propio animal receptor, como la inmunosupresión y fenómenos de escape,

como receptor de injertos de piel humana con tumores cutáneos. En este modelo, objetivaron una disminución del tamaño de los injertos con el tiempo, así como eliminación de las células neoplásicas procedentes de melanomas malignos y enfermedad de Paget extramamaria. Para mejorar el modelo, desarrollaron dos nuevas cepas: ratones nude-scid (atímicos, sin pelo y con falta de linfocitos B y T funcionantes) y beige-scid (defectos en la actividad de células NK y en linfocitos B y T). El estudio reveló que las tasas de aceptación de los injertos en nude-scid o beige-scid fueron superiores a las de SCID. Además la tasa de retracción de los injertos fue menor en nude-scid y beige-scid que en ratones SCID. Las dimensiones de los injertos disminuyeron al 50% del tamaño original a los 20 días en SCID, a los 60 días en nude-scid y a los 70 días en beige-scid. La supervivencia de las células neoplásicas en los injertos fue mayor en la cepa nude-scid.

Cabe destacar que el tamaño de los injertos en nuestro modelo (12 cm2_{) fue superior a lo}

publicado por otros autores, la mayoría de los cuales utilizaron injertos de piel humana de entre 1 y

3 cm2_.176,179,184,187,188,190,192,202,212,213 _{Soballe et al.}189 _{son los que mayores dimensiones de piel han}

injertado previo a nuestro modelo. Utilizaron piel obtenida de prepucios de recién nacidos o excesos

cutáneos de abdominoplastias, y la injertaron en defectos de entre 3 y 5 cm2 _{en el dorso de ratones}

SCID, para posteriormente administrar radiación UVB y estudiar el proceso de carcinogénesis. Otros modelos de trasplante de piel humana sobre ratón fueron usados para estudiar el proceso de

rechazo. Murray et al.211 _{trasplantaron injertos de piel de 7x7 mm en ratones CB-17 SCID. Después}

de 2 semanas, se observaron cambios que se asemejaban a rechazo de piel en humanos. Racki et al.

202 _{estudiaron trasplante de piel humana en ratones inmunodeprimidos y rechazo tras injerto de}

células alogénicas mononucleares de sangre periférica. Trasplantaron 1,5 cm2 _{de piel humana en}

ratones NOD-scid IL2rγ null y CB17-scid bg para este propósito. Recientemente Soria et al.203

publicaron un modelo de ratón NOD-Scid IL2rcnull trasplantado con piel humana de 1 cm2 _para

estudiar el comportamiento in vivo de las células inmunes de la piel. Tras 4 semanas, los estudios revelaron la preservación completa del sistema inmune de piel humana. Aunque todos estos modelos son útiles para estudiar el sistema inmunológico y el proceso de rechazo, ninguno de ellos provee suficientes dimensiones de piel humana normal como nuestro modelo. Las dimensiones de piel viable conseguidas en nuestro modelo, incluso después del proceso de contracción, son suficientes para el estudio de diversas patologías de la piel. Sus dimensiones permiten la creación de úlceras por presión y el estudio del proceso de cicatrización, siempre sobre piel humana.

- Complejidad de la piel humana frente a piel artificial y otras terapias celulares

La piel es el órgano más grande del cuerpo y desempeña numerosas funciones: barrera de protección frente a agentes externos, homeostasis regulando las pérdidas de agua y temperatura corporal, transmisión de información sensitiva, inmunidad, función endocrina al secretar hormonas, citocinas y factores de crecimiento, etc. Su complejidad deriva no solo de las múltiples funciones en las que participa, sino también de las diferentes células y estructuras que la componen. Además,

estas estructuras y células poseen una relación anatómica y funcional.272,273

La ingeniería de tejidos ha avanzado hacia la combinación de materiales sintéticos y biológicos con células cultivadas in vitro para generar tejido funcional. La piel ha sido probablemente una de las primeras aplicaciones prácticas de la ingeniería de tejidos, y es un órgano atractivo para probar nuevos conceptos de medicina regenerativa. En la actualidad, hay un gran número de equivalentes cutáneos disponibles para uso clínico, y la creación de estos sustitutos ha marcado una serie de hitos significativos. Estos equivalentes cutáneos deben cumplir una serie de