Chapter VIII: Conclusions and Outlook
8.4 Validation with experimental data
Al evaluar la especificidad de los primers del endogen hmgA definido para la Multi-target
de maíz, se buscó compararlo con las matrices que componen generalmente los alimentos procesados y que han sido modificados genéticamente como lo son la Soya, el Arroz y el Algodón, con los eventos de transformación genética dentro del alcance de la Multi-target de maíz. Al utilizar Soya 40-3-2 (ERMBF410AK), Arroz del banco de semillas del ICA (AR-S-02) y el Algodón 281-24-236x3006-210-23 (ERMBF422A), se evidenció que el método del Gen de referencia de maíz hmgA presenta amplificación por encima del ciclo 34
para las muestras de Soya, Arroz y Algodón, y amplificaciones en todos los materiales de maíz, entre los ciclos 22,74 y 24,73 (tabla 26 y figura 23). Al realizar el análisis por Melt Curve Genotyping a las condiciones recomendadas por el fabricante (Score Theshold a 0.70
y Resolution Theshold de 0.10) se observó un agrupamiento Positivo para los eventos de
maíz y agrupamiento Unknown para las muestras de arroz, soya, algodón y el control de
reactivos (NTC).
Tabla 26. Especificidad del gen de referencia hmgA por PCR-HRM para la Multi-Target de maíz.
TIPO DE
DETECCIÓN TÉCNICA
MUESTRAS
Matrices Eventos de transformación genética
Arroz Soya Algodón NK603 MON88017 MON89034 MON810 Bt-11 GA21 MIR604 TC1507 MT – Gen
de Referencia
PCR >34 >34 >34 + + + + + + + +
HRM U U U + + + + + + + +
+: Agrupamiento del pico dentro del grupo del control asignado. U: Unknown. Agrupamiento del pico por fuera del grupo del control asignado.
Adicionalmente, para confirmar que el análisis PCR-HRM por segunda derivada y por Melt Curve Genotyping evidenciara resultados óptimos, se realizó una electroforesis con los
productos de amplificación, evidenciándose que el amplicón detectado por en análisis de segunda derivada como amplificación tardía y descartado como amplicón de interés por el análisis Melt Curve Genotyping corresponde a un tamaño inferior al amplicón de interés
(<79 pb) (Figura 24). De acuerdo a Phandanouvong V (2012), estas amplificaciones se pueden generar a partir de la formación de hetero-primers por la interacción de los primers
con la sonda, generando fluorescencia durante el programa de amplificación. Pese a esta amplificación tardía, el método PCR-HRM demuestra ser específico para los eventos de maíz dentro del alcance de la Multi-target de maíz y para los eventos que contienen las líneas hibridas comerciales que componen los eventos de transformación genética dentro del alcance de la Multi-target. Adicionalmente, los parámetros de análisis de resultados para Melt Curve Genotyping resultaron ser óptimos para el análisis de la especificidad de la
amplificación de hmgA. Teniendo en cuenta que la prueba completa de PCR-HRM para el
Gen de referencia hmgA tiene un total de 80 pozos montados entre los montajes de arroz,
soya, algodón, maíz y los controles, únicamente con PCR se tenían 28 falsos positivos de 80, mientras que el análisis completo por PCR-HRM muestra cero falsos positivos y falsos negativos; estos resultados concuerdan con los obtenidos por Norambuena P. y Colaboradores (2009) y Tindall E. y colaboradores (2009) los cuales afirman que sus métodos validados de PCR-HRM fueron 100% sensibles y específicos para el objetivo de la amplificación.
Figura 23. Gráfica de segunda derivada para el programa de amplificación (a), comportamiento de la fluorescencia al aumento de temperatura (b) y la derivada negativa de la fluorescencia (c) de la especificidad
del gen de referencia hmgA. b.
c. a.
Figura 24. Gel de la electroforesis de la amplificación de hmgA con: 1) Marcador de peso, 2)Non Template Contro (NTC) o control de reactivos, 3) Control -, 4) Arroz, 5) Soya, 6) Algodón, 7) MON89034xNK603, 8) MON88017, 9)NK603, 10) MON810, 11) GA21, 12) Bt11, 13) MIR604 y 14) TC1507.
Por otra parte, las dos Dúplex del Screening de la Multi-target de maíz mostraron una
especificidad favorable de acuerdo a los datos esperados (tabla 27). Particularmente para pFMV y para pACT, se obtuvo 100% de especificidad de acuerdo a los resultados teóricos consultados en las bases de datos. Para p35S se encontró una amplificación tardía con Cp mayor a 35 para los eventos GA21 y MIR604, mientras que para tNOS se encontró amplificación tardía con Cp mayor a 35 para el evento TC1507. Esta información concuerda con los publicados por Waiblinger H. y colaboradores en 2010 como documento de soporte por la JRC para los laboratorios de la ENGL-GMFF, la cual afirma que se presenta amplificación tardía de p35S para los eventos MIR604 y GA21, y amplificación tardía para tNOS en el evento TC1507. Particularmente, para MIR604 se encuentran trazas del evento MON863 el cual contiene p35S y para el evento GA21 se tienen trazas del evento MON810 el cual también cuenta con p35S (IRMM, 2011). Para el evento TC1507 no se asocia la amplificación tardía a trazas de algún evento que contenga tNOS. Es importante tener en cuenta que la amplificación tardía de p35S para MIR604 y GA21, y tNOS para TC1507 no genera problema para la Multi-target de maíz, debido a que la identificación evento específica detecta la presencia de estos eventos con Cp bajos desde que se encuentren por encima del LOD de la técnica, esto evita la incidencia de falsos positivos.
Adicionalmente, para el dúplex pFMV-p35S se observa un bajo efecto del filtro dominante 465-510 nm del fluorocromo FAM frente al de baja dominancia 533-580 nm del fluorocromo HEX (figura 25). Particularmente, el efecto se presenta por la influencia de la alta fluorescencia del filtro FAM sobre el filtro HEX. Este efecto no se presenta directamente para esta pareja de primers, debido a que el único material que contienen la
muestra pFMV también contiene p35S. Sin embargo, sí se observa un leve aumento en la fluorescencia background de los materiales negativos para el filtro HEX, sin afectar la
Tabla 27. Especificidad de los primers de los Dúplex pFMV-p35S y tNOS-pACT para los eventos dentro del alcance del Screening de la Multi-target de maíz.
TIPO DE
DETECCIÓN Dúplex
AMPLI- CÓN
MUESTRAS
Eventos de transformación genética
NK603 MON88017 MON89034 x NK603 MON810 Bt-11 GA21 MIR604 TC1507
PCR HRM PCR HRM PCR HRM PCR HRM PCR HRM PCR HRM PCR HRM PCR HRM Resultados prácticos a partir de la Multi- target de maíz 1 pFMV - p35S + + U + - U + + + + + + - U - U - U - U - U + + + >35 + >35 + + + 2 pACT + + tNOS + + + + + + + + + + - - U - U + + - U - U U + + + + + + >35 + Datos teóricos a partir de bases de datos* 1 pFMV p35S + - + - + + + - + - - - - - + - 2 pACT tNOS + + + + + + - - + - + + + - - - * Datos tomados de http://cera-gmc.org/index.php?action=bibliography_database
+: Agrupamiento del pico dentro del grupo del control asignado. U: Unknown. Agrupamiento del pico por fuera del grupo del control asignado.
confiabilidad en la técnica. De manera inversa, no se observa ningún efecto de la fluorescencia de HEX frente a la medición de fluorescencia en VIC teniendo en cuenta que de este material si se tienen positivos únicamente para p35S como Bt11, NK603, MON88017, MON88017, TC1507 y MON810.
Figura 25. Gráfica de segunda derivada para el programa de amplificación (a), comportamiento de la fluorescencia al aumento de temperatura (b) y la derivada negativa de la fluorescencia (c) de la especificidad
del dúplex pFMV-p35S. A. pFMV. B. p35S B A a. b. b. c. c. a.
El análisis por Melt Curve Genotyping con Score Theshold de 0.80 y Resolution Theshold
de 0.10, mostró una correcta agrupación de los perfiles de fusión analizados a los grupos a partir de los controles asignados para el dúplex pFMV-p35S.
En el Dúplex tNOS-pACT se observa un poco de efecto de la fluorescencia del filtro 465- 510 nm sobre el 533-580 nm. Este efecto se puede observar en la parte B de la figura 26, en las amplificaciones negativas de color verde, las cuales muestran un leve aumento luego del ciclo 25 que no se mantiene en el paso de los ciclos. Pese a un leve aumento en la fluorescencia, el análisis por Segunda derivada define estas muestras como negativas, confirmando estos resultados por Melt Curve Genotyping. Estos resultados sugieren que
existe un efecto visual en las gráficas de segunda derivada, el cual por PCR-HRM no representa una fuente variación que pueda afectar la confiabilidad del método.
Figura 26. Gráfica de segunda derivada para el programa de amplificación (a), comportamiento de la fluorescencia al aumento de temperatura (b) y la derivada negativa de la fluorescencia (c) de la especificidad
del dúplex tNOS-pACT. A. tNOS. B. pACT
Por otro lado, para el análisis por Segunda derivada de pACT, se observan dos réplicas del evento MON89034xNK603 asignadas como una muestra negativa. Pese a la incorrecta asignación del análisis por segunda derivada, bajo los parámetros de análisis Melt Curve Genotyping la muestra es correctamente agrupada a los resultados positivos a partir del
control utilizado, confirmando que la técnica PCR-HRM es un método de alta Sensibilidad y especificidad (Norambuena P., et. al., 2009; Tindall E., et. al., 2009). Finalmente, luego
de realizar un total de 288 reacciones teniendo en cuenta toda la prueba de especificidad y sensibilidad de los dos dúplex por PCR-HRM, se observan cero falsos positivos lo que demuestra que el método es altamente confiable.
B A
a. a.
b. b.
Tabla 28. Especificidad de los primers Evento específicos para los eventos dentro del alcance del Screening de la Multi-target de maíz.
TIPO DE
DETECCIÓN AMPLICÓN
MUESTRAS
Eventos de transformación genética
NK603 MON88017 MON89034 MON810 Bt-11 GA21 MIR604 TC1507
PCR HRM PCR HRM PCR HRM PCR HRM PCR HRM PCR HRM PCR HRM PCR HRM MT - Evento Específico NK603 + + - U - U - U - U - + - U - U MON88017 - U + + - U - U - U - + - U - U MON89034 - U - U + + - U - U - + - U - U MON810 - U - U - U + + - U - + - U - U Bt-11 - U - U - U - U + + - + - U - U GA21 - U - U - U - U - U + + - U - U MIR604 - U - U - U - U - U - + + + - U TC1507 - U - U - U - U - U - + - U + +
+: Agrupamiento del pico dentro del grupo del control asignado. U: Unknown. Agrupamiento del pico por fuera del grupo del control asignado.
Figura 27. Gráfica de segunda derivada para el programa de amplificación (a), comportamiento de la fluorescencia al aumento de temperatura (b) y la derivada negativa de la fluorescencia (c) de la especificidad
del método Evento específico de detección de MIR604 (A) y MON810 (B).
Para la detección Evento específica de la Multi-target de maíz, se observó una especificidad del 100% para todos los eventos de transformación genética bajo el método de PCR (tabla 28 y Figura 27, 28, 29 y 30). Por otro lado, el análisis por Melt Curve Genotyping a Score Theshold de 0.70 y Resolution Theshold de 0.10, mostró resultados óptimos para el
agrupamiento de los perfiles de fusión a excepción del método de detección Evento específica de GA21. Específicamente para el evento GA21, bajo el análisis de Melt Curve
a. b. c. a. b. c. A B
Figura 28. Gráfica de segunda derivada para el programa de amplificación (a), comportamiento de la fluorescencia al aumento de temperatura (b) y la derivada negativa de la fluorescencia (c) de la especificidad
del método Evento específico de detección de MON88017 (A) y MON89034 (B).
Genotyping no diferencia los resultados positivos de los desconocidos (Unknown) (gráfica
30 a.). Pese que el análisis no agrupa los resultados, visualmente es posible diferenciar las muestras positivas de las que deberían agruparse como Unknown. Como se puede observar
en la Figura 30 A. b., los resultados positivos agrupados por el análisis Melt Curve Genotyping son los perfiles azules y existen dos grupos, que los separa una franja blanca.
Los perfiles de fusión de la parte superior son los correspondientes a GA21 y reales positivos para esta prueba. Por tal razón, un análisis de la gráfica de fluorescencia en función de la temperatura define los positivos por HRM para la detección Evento específica para GA21.
Como se observa en la gráfica 30 de la fluorescencia en función de la temperatura del perfil de fusión (b.), es fácilmente diferenciable entre la muestra de GA21 y los otros materiales de maíz. Sin embargo, en función del algoritmo de análisis de resultados todos los perfiles a excepción de MON89034xNK603 fueron agrupados bajo el perfil del grupo de positivos. Específicamente para este caso, es necesario analizar los datos de HRM antes de emitir un resultado. Sin embargo, es necesario aclarar que el programa LightCycler 480 SW 1.5 fue diseñado como una herramienta robusta para la diferenciación pequeñas modificaciones a partir de una cadena de oligonucleótidos conocida y se le está dando un uso nuevo el cual hasta ahora se está validando.
Teniendo en cuenta que para el método Evento específico de GA21 es necesario realizar un análisis para interpretar correctamente los resultados por parte del Analista de laboratorio,
a. b. c. a. b. c. A B
se puede decir que todo el método de detección Evento específica de la Multi-target de maíz, es 100% específico y no tiene la incidencia de falsos positivos. Adicionalmente, el algoritmo de análisis de resultados por Melt Curve Genotyping diferencia visualmente los
resultados bajo la gráfica de fluorescencia en el aumento de temperatura y muestra los picos característicos para la HRM.
Figura 29. Gráfica de segunda derivada para el programa de amplificación (a), comportamiento de la fluorescencia al aumento de temperatura (b) y la derivada negativa de la fluorescencia (c) de la especificidad
del método Evento específico de detección de NK603 (A) y TC1507 (B).
Por otro lado, la sensibilidad del método del Gen de referencia de la Multi-target de maíz, mostró un LOD absoluto para PCR de 0,1 ng (tabla 29) el cual está calculado aproximadamente en 37 copias (Arumuganathan K. y Earle ED., 1991, Hübner P., et. al.,
2001), de acuerdo a que se considera el LOD como la menor cantidad de ADN detectada al 100% (ENGL, 2011b). Estos datos confirman los resultados desarrollados por Phandanouvong V. en el “Informe de validación y verificación del método no normalizado
para la cuantificación relativa del evento de maíz TC1507 empleando la técnica de PCR en
tiempo real” el cual afirma el LOD absoluto para hmgA en 37 copias para la técnica de
PCR en tiempo real. Sin embargo, para PCR-HRM se determinó un LOD absoluto de 0,2 ng o 74 copias debido a que al analizar los resultados por Melt Curve Genotyping a Score Theshold de 0.70 y Resolution Theshold de 0.10, para 0,1 ng se obtuvieron únicamente 8
positivos de un total de 10 réplicas. Esta diferencia se obtiene debido a la sensibilidad de HRM bajo el análisis Melt Curve Genotyping bajo las condiciones analizadas. En la primera amplificación para definir el LOD de hmgA, el análisis maneja dos características
que son Score y Resolution los resultados agrupados como positivos tienen resultados de
a. b. c. a. b. c. A B
Score entre 0.86 y 1.0 con resultados de Resolution por encima de 0.19, lo que indica que
son perfiles de fusión que son altamente parecidos al control y que se obtiene una diferencia mínima de 0.19 con respecto al perfil de fusión Unknown. Sin embargo, para la
concentración de 0.05% la cuarta y quinta réplica fueron agrupadas como Unknown con
resultados de Score de 0.78 y 0.07, y resultados de Resolution de 0.04 y de 0
respectivamente. Esto demuestra alta astringencia de los parámetros de análisis a Scorede 0.7 y Resolution 0.1. Si por ejemplo se disminuyera el coeficiente de resolución en
comparación (Resolution) al grupo Unknown a 0.04, la cuarta y la quinta réplica se
convertirían en positivas. Sin embargo, al disminuir el parámetro de análisis Resolution se
facilitaría la existencia de falsos positivos y falsos negativos correspondientes a matrices diferentes a la analizada.
Figura 30. Gráfica de segunda derivada para el programa de amplificación (a), comportamiento de la fluorescencia al aumento de temperatura (b) y la derivada negativa de la fluorescencia (c) de la
especificidad del método Evento específico de detección de GA21 (A) y Bt11 (B). Tabla 29. Sensibilidad del gen de referencia hmgA por PCR-HRM para la Multi-Target de maíz.
Característica
Cantidad de ADN (ng)
0,2 0,1 0,05
PCR HRM PCR HRM PCR HRM
Número de amplificaciones
positivas / total de réplicas 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 0/0
% de amplificaciones positiva 100 100 100 8/10 100 0 a. b. c. a. b. c. A B
Como se puede observar en la gráfica 31, a pesar que en el análisis por segunda derivada (a.) se observa amplificación para la concentración de 0,1 ng de todas las réplicas montadas para esta PCR, en el análisis de Melt Curve Genotyping (b.) se evidencian dos replicas
agrupadas como negativas.
Figura 31. Gráfica de segunda derivada para el programa de amplificación (a), comportamiento de la fluorescencia al aumento de temperatura (b) y la derivada negativa de la fluorescencia (c) de la sensibilidad
del Gen de referencia hmgA.
De igual forma como en el análisis de los resultados de la prueba de especificidad del
hmgA, el pico del perfil de fusión de estas dos réplicas es un hetero-primer por la
interacción de los primers con la sonda, lo cual genera una fluorescencia durante el
programa de amplificación (Phandanouvong V, 2012) pero no corresponde al producto de a.
b.
amplificación deseado. Estos resultados sugieren que la especificidad y la sensibilidad del método PCR-HRM es muy alta (Norambuena P., et. al.,2009; Tindall E., et. al., 2009),
debido a que el análisis de dos características a partir de una PCR-HRM (Cp y perfil de fusión) y no una como ocurre en la PCR en tiempo real (Cp), aumenta la especificidad y la sensibilidad del método, asegurándolo de falsos positivos o negativos de los resultados que realmente son positivos o negativos.
La sensibilidad para los dúplex del Screening de la Multi-target de maíz, mostraron
diferentes tipos de LOD relativos por la diversidad de materiales que se estaban utilizando (tabla 30, 31, 32 y 33).
Tabla 30. Sensibilidad de pFMV del Dúplex pFMV-p35S por PCR-HRM para la Multi-Target de maíz. EVENTO CARACTERÍSTICA CANTIDAD DE ADN (%) 0,1 0,05 0,025 PCR HRM PCR HRM PCR HRM MON89034 x NK603 Número de amplificaciones
positivas / total de réplicas 10/10 10/10 10/10 10/10 0/0 0/0 % de amplificaciones
positiva 100 100 100 100 0 0
A nivel particular, para pFMV se determinó un LOD absoluto de 0,05% esto debido a que únicamente el maíz MON89034xNK603 contenía ese promotor. Por otro lado, para p35S se evidenció que para los eventos Bt11, NK603, TC1507 y MON89034 la mínima concentración de ADN que se logra detectar en un 100% de réplicas es de 0,05%; mientras que para los eventos MON88017 y MON810 el LOD relativo es 0,1%. Teniendo en cuenta que el LOD de una técnica de identificación de múltiples analitos debe garantizar la identificación a un 100% de todos los analitos a identificar (Mano J., et. al., 2009; Querci
M., et. al., 2009), el LOD relativo para el Dúplex pFMV-p35s de la Multi-target de maíz es
de 0,1%.
Para el dúplex tNOS-pACT se obtuvieron resultados parecidos a los evidenciados en el dúplex pFMV-p35S. Específicamente para tNOS, los eventos GA21, MIR604, NK603 y MON89034xNK603 mostraron un LOD absoluto de 0,05% mientras que para los eventos Bt11 y MON88017 el LOD absoluto fue de 0,1%. Para pACT se observa que NK603 muestra un LOD absoluto de 0,05% mientras que GA21 y MON88017 muestran un LOD absoluto de 0.1%. Particularmente para pACT, como se observa en la tabla 33, al observar NK603 bajo el análisis de Segunda derivada para la concentración de 0,1%, se evidencian 8 réplicas positivas de 10 montadas mientras que para HRM se tienen 10 de 10 réplicas positivas. Adicionalmente, para la concentración de 0,05%, para análisis por Segunda derivada 10 réplicas positivas de 10 montadas y por HRM 10 réplicas positivas de 10 realizadas. Si a una concentración menor se tienen un porcentaje de amplificación del 100%, teórica y prácticamente al doble de la concentración debería tener un porcentaje de amplificación del 100%. Este caso en particular se presenta porque de acuerdo al algoritmo
de análisis de Segunda derivada define la muestra como negativa a pesar que se presenta amplificación. Para el caso específico del equipo LightCycler 480, se puede solucionar este inconveniente implementando el kit de compensación de color. Sin embargo existe un problema para la implementación de acuerdo al uso de los fluorocromos FAM y HEX. El problema es que no se existe kit de compensación de color para FAM y HEX porque son fluorocromos por fuera de patente de Roche. Sin embargo, al observar el método bajo PCR-HRM el inconveniente de interpretación de los resultados de pACT con el evento NK603, es totalmente superado como se observa en la tabla 33, en la cual para la concentración de 0,1% se tienen 10 réplicas positivas de 10 réplicas montadas.
Tabla 31. Sensibilidad de p35S del Dúplex pFMV-p35S por PCR-HRM para la Multi-Target de maíz. EVENTO CARACTERÍSTICA CANTIDAD DE ADN (%) 0,1 0,05 0,025 PCR HRM PCR HRM PCR HRM Bt11 Número de amplificaciones
positivas / total de réplicas 10/10 10/10 10/10 10/10 7/10 7/10 % de amplificaciones
positiva 100 100 100 100 70 70
MON88017
Número de amplificaciones
positivas / total de réplicas 10/10 10/10 7/10 7/10 2/10 2/10 % de amplificaciones
positiva 100 100 70 70 20 20
MON810
Número de amplificaciones
positivas / total de réplicas 10/10 10/10 8/10 9/10 8/10 7/10 % de amplificaciones
positiva 100 100 80 90 80 70
NK603
Número de amplificaciones
positivas / total de réplicas 10/10 10/10 10/10 10/10 9/10 9/10