VAT and deviations from the ALP in the EU

Preparación de soluciones patrón de BZN

Se dispuso de BZN, de grado de pureza indeterminado, provisto por Roche Argentina. Este se presenta como una sustancia pulverulenta, de granulación regular, inodora e incolora. Se evaluó en una primera instancia la solubilidad de la droga sólida en

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distintos solventes orgánicos. Estos resultados se exponen en la sección Resultados: Tabla

4.2.1.1.

Se preparó una solución patrón (SP) de concentración 4,512 mg/mL, mediante la solubilización total de la droga sólida por agregados consecutivos de volúmenes de DMSO y luego el enrrase en matraz de 5,00 mL con acetato de etilo.

Se comprobó la pureza cromatográfica del patrón mediante las condiciones cromatográficas descriptas en la Tabla 3.2.1.1.1 presentada a continuación, observándose la ausencia de impurezas significativas, como podemos apreciar en el siguiente cromatograma de la Figura 3.2.1.1.1.

Figura 3.2.1.1.1.

Soluciones de trabajo (ST) de 18,048 µg/mL y 4,512 µg/mL, se prepararon por la dilución de cantidades adecuadas de SP en solvente de corrida (más adelante se explica la selección del solvente de corrida). Se verificó la estabilidad de las soluciones, conservadas a 5°C, observándose que después de 6 meses, no hay pérdida significativa del título.

SISTEMAS CROMATOGRÁFICOS EVALUADOS:

Para la selección de la longitud de onda se realizó barrido del espectro UV para localizar los máximos de absorción. Si bien se halló más un máximo de absorbancia se

eligió una longitud de onda donde se esperaba que la interferencia por parte de otros compuestos fuera mínima. Ver Resultados: Gráfico 4.2.1.1.

En base a las publicaciones existentes al inicio de nuestros desarrollos con BZN,85,86,87 y teniendo en cuenta estimaciones teóricas respecto de la polaridad del compuesto y su solubilidad en distintas solventes y buffers, se realizaron ensayos cromatográficos con las ST realizadas de BZN corroborando que respondieran aceptablemente a la relación señal/ruido del equipo.

Se probó una columna de relleno C-18 de dimensiones: 100 x 4,6 mm y 5 µm de tamaño de partícula. Se evaluaron tiempos de retención, resolución de picos cromatográficos en distintas condiciones de flujo y fase móvil. Se evaluó un modo cromatográfico de fase reversa y para distintos gradientes y fases móviles fijas para un sistema isocrático. Ver en Resultados: Tabla 4.2.1.3.

De estos ensayos se eligió la fase móvil, la longitud de onda y la composición de los solvente de disolución del BZN que generaron las mejores respuestas cromatográficas, tal como se indica en la Tabla 3.2.1.1.1. La elección de un buffer con par iónico fue en virtud de las propuestas de la bibliografía consultada.86 El buffer glicina se preparó con una solución 0,20 M en glicina, 5,00 mM en ONA y llevado a pH 2,5 con HCl concentrado.

Tabla 3.2.1.1.1.

Condiciones cromatográficas seleccionadas

Columna: C-18; (100 x 4,6) mm. 5 µm

Fase Móvil: Buffer Glicina-ONA: Acetonitrilo (70:30)

Flujo: 1 mL/min

Longitud de onda: 313 nm

Para el desarrollo de un método para la extracción, detección y cuantificación por HPLC-UV de BZN en plasma humano, en una primera instancia se evaluaron las técnicas propuestas en bibliografía.85,86,87

85

Raauflaub J, Ziegler WH. Single-dose pharmacokinetics of the trypanomicide benznidazole in man.

Arzneim Forsch Drug Res 1979;29:1611–1614 86

Walton MI, Workman P. Reversed-phase high performance liquid chromatographic method for the simultaneous determination of the 2-nitroimidazole benznidazole and its amine metabolite in biological fluids. J Chrom 1986;375:190–196

87

Guerrero L, Pinazo MJ, Posada E, Gascón J, Ribas J, Soy D. A high-performance liquid chromatographic method for benznidazole quantitation in plasma of patients with Chagas disease. Clin Chem Lab Med 2011;49:77–82

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Se probaron las siguientes variantes de extracción. Las recuperaciones de BZN encontradas para cada variante se exponen en Resultados: Tabla 4.2.1.1.1.

EXTRACCIÓN LÍQUIDO -LÍQUIDO VARIANTE (1) :

Para 2,0 mL de plasma oxalatado adicionado con BZN a concentración fija conocida, se le adicionó 4,0 mL de agua y 2,0 mL de ácido metafosfórico al (20%p/v). Se vorteó enérgicamente por el lapso de 30 segundos y se centrifugó a velocidad máxima 10 minutos. Luego, se tomaron 5,0 mL del sobrenadante y se agregó 280 µL de NaOH 5N. Se agitó manualmente y se procedió a una etapa de extracción con solvente orgánico: 20,0 mL de cloroformo con isoamilcarbinol al 1%v/v. Se vorteó durante 1 minuto y se llevó a sequedad mediante corriente de nitrógeno. Se resuspendió en metanol y otra fracción procesada de la misma manera en acetonitrilo. Los extractos resuspendidos se inyectaron en HPLC.

EXTRACCIÓN LÍQUIDO -LÍQUIDO VARIANTE (2) :

A 2,0 mL de plasma adicionado con BZN a concentración conocida y anticoagulado con heparina, se le agregaron 4,0 mL de metanol y luego se agitó por 30 segundo con vórtex. Se centrifugó a velocidad máxima 10 minutos. El sobrenandante se llevó a sequedad mediante corriente de nitrógeno.

Se resuspendió en metanol y otra fracción procesada de la misma manera en acetonitrilo. Los extractos resuspendidos se inyectaron en HPLC.

EXTRACCIÓN SÓLIDO -LÍQUIDO VARIANTE (1):

En esta técnica se recurrió a la variante de trabajar con un volumen de plasma adicionado con BZN a concentración fija conocida y heparinizado, previamente liofilizado.

Se partió entonces, de 2,0 mL de plasma heparinizado liofilizado que luego de una etapa de pulverización con varilla se le adicionó 4,0 mL de metanol como solvente de extracción. Se agitó en vortex por 30 segundos y luego se centrifugó a velocidad máxima por 10 minutos.

El sobrenadante se llevó a sequedad mediante corriente de nitrógeno y se resuspendió en distintas oportunidades con metanol, acetonitrilo y mezlcas de de ambos. Los extractos resuspendidos se inyectaron en HPLC.

EXTRACCIÓN SÓLIDO -LÍQUIDO VARIANTE (2):

A 2,0 mL de plasma liofilizado adicionado con BZN a concentración fija conocida y heparinizado, se le agregó 4,0 mL de acetato de etilo como solvente de extracción. Se agitó en vortex por 30 segundos y luego se centrifugó a velocidad máxima por 10 minutos. El sobrenadante se llevó a sequedad mediante corriente de nitrógeno y se resuspendió en metanol, acetonitrilo y mezlcas de de ambos. Los extractos resuspendidos se inyectaron en HPLC.

Del análisis de las recuperaciones halladas para cada variante se eligió continuar estudiando la que arrojaba mejores porcentaje de recuperación (% R). Resultados: Tabla

4.2.1.1.1. Para optimizar la técnica elegida se evaluaron pasos de desproteinizado del

plasma liofilizado, ajuste de pH, llevado a sequedad mediante rotavapor en lugar de corriente de nitrógeno y sonicado de la muestra, antes de la etapa de centrifugación (Tabla 3.2.1.1.2).

Tabla 3.2.1.1.2.

Pasos evaluados: Solvente utilizado Volumen utilizado (µL) Tiempos evaluados(min) Desproteinización ácida TCA 10%, 30%p/v 100, 150 y 200 -

Ajuste a pH neutro NaOH 10 %, 20%p/v 100, 150 y 200 -

Sonicado - - 5, 10 y 15

Centrifugado - - 5, 10 y 15

Los resultados de estas evaluaciones se analizan en Resultados: 4.2.1.2.

Optimización de la técnica seleccionada para la extracción de BZN en plasma humano.