5.1.2.1 Uso de Tritón X-100 y diferentes pHs para la solubiización de proteínas de membrana
Las proteínas de membrana pueden ser clasificadas en dos: las integrales y las periféricas. Las primeras tienen uno o más segmentos embebidos en la bicapa lipídica por medio de cadenas hidrofóbicas. Estas cadenas interaccionan con los grupos lipofílicos de los fosfolípidos de la membrana, anclando la proteína a la membrana y extendiéndose a lo largo de ésta (Lodish, et al., 2000).
Las proteínas periféricas no interaccionan con el núcleo hidrofóbico de la membrana. Pueden unirse indirectamente, mediante interacciones con las proteínas integrales de membrana, o directamente, por interacciones con las cabezas polares de los fosfolípidos. Uno de los grupos que conforman estas proteínas son las enzimas hidrosolubles asociadas a las cabezas polares de los fosfolípidos. Por ejemplo, las fosfolipasas, que tienen un rol muy importante en la degradación de membranas dañadas o viejas (Lodish et al., 2000). Es por todo esto que se consideró relevante buscar enzimas proteolíticas entre las proteínas de membrana, debido a que son importantes en varios mecanismos celulares.
Granados-Pérez (2009) extrajo proteínas adheridas a membrana con Tritón X- 100 y obtuvo una banda de actividad proteolítica aproximadamente a 80 kDa; Casales-Cabrera (2012) también extrajo proteínas adheridas a membrana aproximadamente a 116 kDa y 60 kDa. Debido a esto se procedió a tratar de reproducir este resultado. Después de la obtención del paquete celular se hizo un gel de actividad de gelatina como sustrato. Se usó material proveniente de una fermentación de 12 h en medio MRS modificado.
Se realizaron técnicas de extracción de proteínas de membrana utilizando un intervalo amplio de pH y diferentes concentraciones de Tritón X-100, a partir de estas técnicas se obtuvó una gran variedad de proteasas de diferentes masas moleculares. El tratamiento con diferentes pHs permitió extraer 3 diferentes proteasas, una de 200 y otra de 116 kDa, las cuales estuvieron presentes en todo el intervalo. También se encontró una proteasa de 97 kDa que se presentó sólo a pH 6 y 7. La extracción con Tritón X-100 se realizó repetidas veces. Se obtuvieron 6 diferentes proteasas para cuatro concentraciones diferentes (3%, 2%, 1% y 0.5%).
Tabla 7. Análisis de proteasas adheridas a membrana obtenidas a partir de Tritón X-100 Concentración Masas moleculares de diferentes proteasas
Tritón X-100 al 3% >200 kDa, ≈116 kDa, ≈ 50 kDa, <45 kDa ≈ 25 kDa Tritón X-100 al 2% >200 kDa, ≈116 kDa, ≈97 kDa, ≈66 kDa
Tritón X-100 al 1% <200 kDa, ≈66 kDa
Tritón X-100 al 0.5% <200 kDa, 116 kDa, 97 kDa
Los detergentes imitan la membrana celular formando agregados estables llamados micelas. Las micelas están caracterizadas por una concentración crítica micelar (CMC), por debajo de este valor las moléculas individuales de detergente predominan en la solución. La CMC varía mucho entre diferentes clases de detergentes y puede ser influenciada por la temperatura, pH y sales (Ohlendieck, 1996).
El Tritón X-100 es un detergente no iónico no desnaturalizante que permite la investigación de la estructura de proteínas de membrana; se une fuertemente a las proteínas, tiene una masa molecular micelar de aproximadamente 150 moléculas de detergente. Éste es considerado alto debido a que las micelas que forma tienden a tener una proporción mayor de moléculas de detergente que de proteína. El Tritón X-100 se caracteriza por tener una masa molecular de 90-95 kDa, una cabeza polar muy voluminosa y un valor de CMC de 0.3 mM, que es considerado pequeño. Por su gran tamaño limita la difusión y migración y por su valor bajo de CMC, el Tritón X-100 no puede ser removido por diálisis o ultrafiltración (Furth et al., 1984).
Ya que el experimento para la extracción de proteínas adheridas a membrana se repitió un gran número de veces sin obtener resultados reproducibles, se puede suponer que la solubilización de proteínas de membrana a partir de Tritón X-100 es muy complicada debido a la difícil remoción de éste (Schnaitman, 1971).
Sin embargo, se encontraron varias proteínas con actividad proteolítica intensa descritas ya en la Tabla 7. Al compararse estos resultados con el análisis in- sílico de proteasas dentro del genoma de P. acidilactici (Tabla 6) se encontró que algunos de las masas moleculares que se presentaron no están registradas en la literatura. De esta manera se puede observar que el sistema proteolítico de esta BAL es en verdad bastante complejo y que falta aún por hacer mucha investigación.
5.1.2.2 El medio de cultivo en la fermentación llevada a cabo por P. acidilactici
El medio MRS modificado es un medio de cultivo que favorece el crecimiento de bacterias ácido lácticas al proveer una excelente fuente de carbono y de nitrógeno. Por otro lado, el medio TSB (Caldo Soya Tripticaseína) contiene niveles menores de estas fuentes, lo que hace que la bacteria crezca más lentamente y provoca a su vez un estrés nutricional que activa proteasas para la mejor utilización de los nutrientes presentes en el medio (Stockwell et al.,
2005).
Los microorganismos son capaces de utilizar una gran variedad de fuentes de nitrógeno presentes en un medio, si esta fuente es fácilmente metabolizable, la síntesis de enzimas relacionadas con el metabolismo primario y secundario de este microorganismo se reprimen hasta que el sustrato principal se acaba. Numerosas vias del metabolismo secundario son afectadas negativamente por fuentes nutrimentales que favorecen el crecimiento microbiano, como las sales de amonio. Además, concentraciones muy altas de nitrógeno afectan la síntesis de enzimas como las proteasas (Sánchez y Demain, 2002).
La síntesis de una proteasa es incrementada por niveles insuficientes de nitrógeno o carbono en el medio de cultivo. Esto se debe a que el microorganismo busca la degradación de otras fuentes de nitrógeno como alternativa, incrementando así su actividad aún cuando la biomasa se ve reducida. La síntesis, además, es reprimida por altos niveles de producto final como aminoácidos o NH4+ y por fuentes de carbono fácilmente metabolizables (Geissler y Horwath, 2008).
Comparando los medios de cultivo utilizados, el medio MRS modificado contiene como fuentes de nitrógeno orgánico: peptona de proteasa, extracto de carne y extracto de levadura. Como fuente de carbono contiene hasta 8 veces más glucosa (en forma de sacarosa) que el medio TSB (en forma de glucosa) en donde la fuente de nitrógeno orgánico se encuentra en menor proporción con digeridos pancreáticos de caseína y de harina de soya. Por lo tanto, podría suponerse que se tendrá una síntesis de proteasas diferente en el medio TSB
que mantiene a la célula con una limitante de fuente de nitrógeno y de carbono a comparación del medio MRS modificado.
Figura 14. Actividad proteolítica en zimograma de gelatina al 1%. Carril 1, marcador de altoa masa molecular (Bio-rad); carril 2, célula entera medio TSB (Contreras-Cruz, 2012).
Se puede observar la actividad proteolítica encontrada en células enteras en medio TSB a 16 h presentada aproximadamente a 120 kDa (Figura 14). Debido a este resultado se procedió a cambiar de medio de cultivo.
5.1.2.3 Perfil electroforético y actividad proteolítica de fermentación en medio de cultivo TSB a 16 h por zimogramas
En las Figuras 15 (A y B) se pueden observar bandas de actividad proteolítica a diferente masa molecular. La fracción intracelular, es decir el citoplasma, presenta una sola banda a 120 kDa cuando el único tratamiento realizado fue el de ultrafiltración por una membrana de 30 kDa. Si posteriormente se liofiliza el ultrafiltrado se observan otras 3 bandas, una por debajo de 120 kDa y otras dos por arriba.
A B
Figura 15. A. Perfil de proteínas de las diferentes fracciones de la célula bacteriana. SDS-PAGE 10%. B. Actividad proteolítica en zimograma de gelatina al 1%. Carril 1, marcador de alta masa molecular (Bio-rad); carril 2, célula entera; carril 3, restos celulares; carril 4, citoplasma ultrafiltrado; carril 5, citoplasma ultrafiltrado liofilizado; carril 6, sobrenadante.
Tabla 8. Establecimiento de las condiciones de producción de proteasas
Condiciones 1 2 3 4 Medio MRS MRS MRS TSB Tiempo de fermentación 12 h 12 h 8 h 16 h Proceso Intervalo de pH de 2 a 10 Tritón X-100 al 3%, 2%, 1% y 0.5% Tritón X-100 al 3%, 2%, 1% y 0.5% Sonicación, ultrafiltración y liofilización de la fracción citosólica Masa molecular de
las proteasas 200, 116 y 97 kDa 116, 98, 97, 200, 120, 90 y 66 kDa
200, 45 y 25
kDa 120 kDa
Reproducibilidad
✖
✖
✖
✔
Se puede observar a partir de la Tabla 8 que la producción de proteasas en
Pediococcus acidilactici ATCC8042 es muy sensible a factores externos. Se observa que la única proteasa que se pudo reproducir fue la de 120 kDa encontrada dentro del citoplasma de la célula bacteriana, realizando la fermentación en medio TSB con un tiempo de fermentación de 16 h. La experimentación se realizó siguiendo este procedimiento debido a que este último se consideró como el modelo de estudio seleccionado después de varias pruebas.
5.2 Segunda fase experimental: Actividad proteolítica sobre diferentes sustratos y caracterización bioquímica de la actividad proteolítica de interés
Para poder clasificar la proteasa de interés es necesario realizar experimentos en los que se observe la respuesta de su actividad proteolítica con respecto a inhibidores o agentes quelantes, activadores, pH y temperatura, así como su especificidad por sustrato.