16. Flash Memory
16.2. Non-volatile Data Storage
3.3.3.1. Conductancia estomática
La CE se tomaron 3 mediciones en 2 hojas expandidas del tercio medio completamente desarrolladas, en dos plantas por tratamiento. Los datos fueron tomados en el periodo comprendido entre 8:00 y las 11:00 según lo descrito por Rodríguez et al., (2017). Las mediciones se realizaron con un porómetro portátil (SC-1 Leaf Porometer. Decagon Devices Inc, Pullman-Gales).
Identificación de variantes alélicas naturales asociadas con tolerancia a estrés hídrico en papa diploide
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3.3.3.2. Contenido de malondialdehído
La peroxidación lipídica se cuantificó a través del contenido de MDA lo que permite conocer el daño a nivel de membranas como indicativo del nivel de estrés. Para esto se tuvieron 3 repeticiones por cada uno de los tratamientos C y E. Estas repeticiones consistieron en 5 hojas nuevas del tercio apical de cada una de las 4 plantas del tratamiento C y E. Con ellas se conformó una única muestra compuesta. La cuantificación del MDA se realizó de acuerdo con la metodología descrita por Heath y Packer (1968). Las hojas fueron maceradas en nitrógeno líquido y del macerado se emplearon 300 mg. El macerado se llevó a tubos Falcon de 15 mL, y se adicionaron 4 mL de ácido tricloracético al 1% p/v. Posteriormente, la reacción se centrifugó durante 10 min a 300 rpm. Se tomó en un tubo falcon 1 mL del sobrenadante y al que se le agregaron 4 mL de una mezcla de ácido tricloracético al 20% y ácido tiobarbitúrico al 0,65% p/v. Los tubos se llevaron a un baño de agua a 95 °C por 25 min. Las muestras se leyeron a 532 y 600 nm en un espectrofotómetro (spectronic BioMate 3 UV-Vis, Thermo, Madison, WI, USA). La fórmula para el cálculo de la concentración en equivalentes de MDA se describe en la tabla 2-1.
3.3.3.3 Contenido relativo de agua
El contenido relativo de agua es un indicador del estatus hídrico de la planta, por ende, se ha reportado su relación con las acuaporinas. El contenido relativo de agua (CRA) fue calculado de acuerdo con la metodología de Liu et al. (2005) usando la ecuación de la Tabla 2-1. Se colectaron hojas del tercio medio según la metodología de Liu et al. (2005) a los 120 DDS. Se tomó el peso fresco hoja con una balanza de precisión (XB220A, Precisa, Swiss), posteriormente se dejó en placas de Petri con agua destilada a 20°C durante 24 horas y se registró su peso nuevamente. A continuación, se llevaron a un horno a 75 °C durante 48 horas y luego de este tiempo se registró su peso.
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Tabla 3-1. Ecuaciones para calcular variables fisiológicas medidas en germoplasma de papa diploide (Solanum tuberosum grupo Phureja).
Nombre Ecuación Malondialdehido (MDA) 𝑀𝐷𝐴𝑒𝑞( 𝑛𝑀𝑜𝑙 𝑚𝑙 ) = [ (𝐴𝑏𝑠 532 + 𝑇𝐵𝐴) − (𝐴𝑏𝑠 532 + 𝑇𝐵𝐴) 155 ] ∗ 1000000 Contenido relativo
de agua (CRA) CRA = (PF-PS)/(PSat-PS) x 100
Abs: Absorbancia; TBA: Ácido tiobarbitúrico; PF peso fresco de la hoja; PSat peso turgente luego de dejarlo en agua destilada a 20°C durante 24 horas; Ps peso seco.
3.3.3.4. Componentes de rendimiento
Para calcular el rendimiento se tomó por separado el peso de la parte aérea y el peso de los tubérculos de cada planta. El material se empacó por separado en bolsas de papel y se secó en un horno a 70 °C marca WTB binder type 78532 Tuttlingen hasta conseguir un peso constante. Posteriormente, el material vegetal se pesó de manera individual, para obtener el peso de la parte aérea (PSA) y el peso seco de tubérculos (PSTb). La suma de PSA y PSTb se tomó como el peso seco total (PST). El número de tubérculos (NUM) y su peso promedio por tubérculos (PPT) fueron tenidos en cuenta al final del ciclo del cultivo y se estimó el rendimiento por planta (R) según la metodología de Lynch y Kozub (1990). Con los pesos individuales, se calculó el Índice de cosecha (IC), la cual es una variable indirecta y se halló con la siguiente fórmula [1]:
Identificación de variantes alélicas naturales asociadas con tolerancia a estrés hídrico en papa diploide
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3.3.3.5 Identificación de variantes alélicas asociadas
con la respuesta al estrés hídrico a través del
enfoque de asociación amplia del genoma
El genoma de la papa consta de 12 cromosomas y tiene una longitud de 840 Mb (PGSC, 2011). Para la identificación de variantes alélicas se aplicó el enfoque de asociación amplia del genoma (GWAS) para lo cual se empleó la matriz de 83,862 SNPs obtenida por genotipificación por secuenciación (GBS) para 150 accesiones de papa (Juyó et al., 2019). Los SNPs fueron obtenidos por GBS con dos sistemas de enzimas, una de corte frecuente y otras de corte raro PstI/MspI, respectivamente (Poland & Rife, 2012). SNPs con más del 10% de datos faltantes y con un MAF< 5% fueron excluidos del análisis y se obtuvo una matriz de 47K SNP.
El GWAS se basó en el modelo lineal mixto comprimido (CMLM) utilizando la herramienta de asociación y predicción integrada (GAPIT) del paquete estadístico R® (Johnson et al., 2010; Zhang et al., 2010). Se eligió el modelo CMLM el cual permitió la agrupación de individuos a partir de la matriz de parentesco medio entre ellos (Tang et al., 2016). De esta manera, los efectos genéticos se toman de manera grupal a diferencia del MLM. Además, los modelos CMLM son más eficientes en cuanto al tiempo computacional y su poder estadístico (Tang et al., 2016).
Las representaciones cuantil-cuantil (QQ) de las probabilidades de la prueba esperada y observada para los marcadores SNP se evaluaron para identificar el modelo apropiado en el control de los errores de Tipo I causados por relaciones de parentesco (Turner et al., 2014; Sukumaran et al.,2012). Se empleó el enfoque estadístico FDR (False Discovery Rate) para corregir y ajustar las medidas de confianza estadística en función del número de pruebas realizadas y eliminar falsos positivos a partir de comparaciones múltiples (Rouam, 2013). No obstante, a que se ha reportado que la población de mapeo no presenta estructura poblacional (Juyó et al., 2019; Juyó et al. 2015).
Para el GWAS, cada variable se tomó por separado y se obtuvieron los resultados para cada tratamiento tanto para plantas bajo estrés por déficit hídrico como para plantas control. Para los SNPs que presentaron asociaciones significativas se buscó sus posiciones de mapeo en el genoma de referencia DM-v4 (Potato Genome Sequencing
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Consortium, 2011). Aquellos SNPs cuya ubicación mapea en la secuencia de un gen, fueron considerados genes candidatos, así como lo fueron aquellos que se encontraron en una ventana de 100 kb alrededor de esta posición por LD como su región flanqueante.