LA 1 Screening Reagent / LA 2 Conrmation Reagent
LA 1 Screening Reagent / LA 2 Conrmation Reagent
LA 1
LA 1
[REAGENT]
[REAGENT]
/ LA 2
/ LA 2
[REAGENT]
[REAGENT]
Simplied Dilute Russell’s Viper Venom Test (DRVVT) for detection ofSimplied Dilute Russell’s Viper Venom Test (DRVVT) for detection of LupusLupus Anticoagulants
Anticoagulants
Intended Use
Intended Use
LA 1 Screening Reagent and
LA 1 Screening Reagent andLA 2 Conrmation Reagent are simplied DRVVT LA 2 Conrmation Reagent are simplied DRVVT reagents for detecreagents for detec- -tion of Lupus Anticoagulants (LA) in one-stage clotting tests.
tion of Lupus Anticoagulants (LA) in one-stage clotting tests.
LA 1 Screening Reagent LA 1 Screening Reagent
Simplied DRVV reagent to screen for the presence of Lupus Anticoagulants.
Simplied DRVV reagent to screen for the presence of Lupus Anticoagulants.
LA 2 Conrmation Reagent LA 2 Conrmation Reagent
Phospholipid-rich DRVV reagent for the specic correction of Lupus Anticoagulants.
Phospholipid-rich DRVV reagent for the specic correction of Lupus Anticoagulants.
Summary and Explanation
Summary and Explanation
LAs are autoantibodies against negatively charged phospholipids or complexes of phospholipids
LAs are autoantibodies against negatively charged phospholipids or complexes of phospholipids
with either beta-2-glycoprotein 1 or clotting factors such as prothrombin. They occur in various
with either beta-2-glycoprotein 1 or clotting factors such as prothrombin. They occur in various
clinical conditions, especially autoimmune diseases
clinical conditions, especially autoimmune diseases11 and are now considered to be a signicant and are now considered to be a signicant
risk factor in patients with otherwise unexplained thrombosis and are
risk factor in patients with otherwise unexplained thrombosis and are often present in women whooften present in women who
have recurrent fetal loss
have recurrent fetal loss55. . LA have traditionally been deteLA have traditionally been detected using phospholipid responsive clotcted using phospholipid responsive clot-
-ting tests, such as the activated partial thromboplastin time (APTT), kaolin clot-ting time (KCT) and
ting tests, such as the activated partial thromboplastin time (APTT), kaolin clotting time (KCT) and
DRVVT
DRVVT22 where they have an anticoagulant effect. where they have an anticoagulant effect.
The DRVV time rst became popular following the publication by Thiagarajan et al. in 1986
The DRVV time rst became popular following the publication by Thiagarajan et al. in 198666. This. This method has been standardized and simplied
method has been standardized and simplied77. According to Petri. According to Petri88 et al., thrombosis in SLE et al., thrombosis in SLE patientspatients is more closely linked with LA detectable by DRVVT than with anticardiolipin antibodies detected
is more closely linked with LA detectable by DRVVT than with anticardiolipin antibodies detected
by enzyme linked immunosorbent assays (ELISA)
by enzyme linked immunosorbent assays (ELISA)55. This observation was recently extended by. This observation was recently extended by
Galli and Bevers
Galli and Bevers99 who showed that the LA subtype with most effect on DRVVT tests is beta- who showed that the LA subtype with most effect on DRVVT tests is
beta-2-glycoprotein 1 dependent and different to the prothrombin-requiring LA subtype having more
2-glycoprotein 1 dependent and different to the prothrombin-requiring LA subtype having more
prolonging effect on KCT tests.
prolonging effect on KCT tests.
Test Principle
Test Principle
1.
1. Russell’s viper venom present in LA 1 Screening Reagent initiate plasma clotting by directlyRussell’s viper venom present in LA 1 Screening Reagent initiate plasma clotting by directly
activating factor X. LA antibodies prolong the LA 1 Screening Reagent clotting time.
activating factor X. LA antibodies prolong the LA 1 Screening Reagent clotting time.
2.
2. LA 2 Conrmation Reagent is similar to LA 1 Screening ReagenLA 2 Conrmation Reagent is similar to LA 1 Screening Reagent but contains a high phospholit but contains a high phospholi- -pid concentration. The extra phospholi-pid counteracts the LA antibody and largely corrects
pid concentration. The extra phospholipid counteracts the LA antibody and largely corrects thethe
clot time
clot time33..
3.
3. DRVV test ”bypass” factor VII of the extrinsic pathway and the contact and antihemophilic facDRVV test ”bypass” factor VII of the extrinsic pathway and the contact and antihemophilic fac- -tors of the intrinsic pathway.
tors of the intrinsic pathway. Therefore LA 1 Screening Reagent is more specic for LA thanTherefore LA 1 Screening Reagent is more specic for LA than
APTTs as they are not affected by contact factor abnormalities or by factor VIII deciencies or
APTTs as they are not affected by contact factor abnormalities or by factor VIII deciencies or
antibodies
antibodies66. There have been a number of tests developed based on phospholipid correction. There have been a number of tests developed based on phospholipid correction44
however none have been as convenient to use as LA 2 Conrmation Reagent subsequent to LA 1
however none have been as convenient to use as LA 2 Conrmation Reagent subsequent to LA 1
Screening Reagent.
Screening Reagent.
4.
4. Mixing tests may be useful to exclude factor II, V and X deciencies, which may prolong LA 1Mixing tests may be useful to exclude factor II, V and X deciencies, which may prolong LA 1
Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent results. Mixing normal plasma with test
Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent results. Mixing normal plasma with test
plasma replenishes any factors decient in the test plasma. If the mixing test is still prolonged,
plasma replenishes any factors decient in the test plasma. If the mixing test is still prolonged,
it indicates that an inhibitor (such as LA) is present in the test plasma.
it indicates that an inhibitor (such as LA) is present in the test plasma. A circulating inhibitorA circulating inhibitor
is usually indicated by a prolonged clotting time result that is not corrected by mixing patient
is usually indicated by a prolonged clotting time result that is not corrected by mixing patient
plasma with normal plasma
plasma with normal plasma3,103,10..
Reagent
Reagent
Composition Composition
LA 1 Screening Reagent and LA 2
LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent contain Russell’s viper venom, Conrmation Reagent contain Russell’s viper venom, phospholiphospholi- -pids, antiheparin agents, calcium, buffers, stabilizers, sodium azide and dyes.
pids, antiheparin agents, calcium, buffers, stabilizers, sodium azide and dyes.
Warnings and precautions Warnings and precautions For
Forin-vitroin-vitrodiagnostic use only.diagnostic use only.
When disposing of azide, always ush with large volumes of water to avoid the possibility of an
When disposing of azide, always ush with large volumes of water to avoid the possibility of an
explosive residue forming in metal plumbing.
explosive residue forming in metal plumbing.
Preparation for use Preparation for use
Reconstitute with the volume of distilled water stated on the vial. Mix well by inversion to ensure
Reconstitute with the volume of distilled water stated on the vial. Mix well by inversion to ensure
complete re-suspension of the lyophilized material.
complete re-suspension of the lyophilized material.
Storage instructions Storage instructions
The lyophilized reagents are stable at least until the expiry
The lyophilized reagents are stable at least until the expiry date stated on the vial label when storeddate stated on the vial label when stored
at +2 to +8 °C.
at +2 to +8 °C.
Following reconstitution reagents can be stored for 8 hours at +37 °C, 24 hours at +20 to +25 °C,
Following reconstitution reagents can be stored for 8 hours at +37 °C, 24 hours at +20 to +25 °C,
48 hrs at +2 to +8 °C and 1 month at -20 °C.
48 hrs at +2 to +8 °C and 1 month at -20 °C.
Indications of instability / deterioration Indications of instability / deterioration If there is no evidence of vacuum when the v
If there is no evidence of vacuum when the vial is opened and/or the reagent does not appear dryial is opened and/or the reagent does not appear dry
it should be returned to Siemens Healthcare Diagnostics.
it should be returned to Siemens Healthcare Diagnostics.
Specimen Collection and Preparation
Specimen Collection and Preparation
Collect and process blood in accordance with NCCLS Standard H21-A3: Collection, Transport and
Collect and process blood in accordance with NCCLS Standard H21-A3: Collection, Transport and
Processing of Blood Specimens
Processing of Blood Specimens for Coagulation Testing and General Performance of Coagulationfor Coagulation Testing and General Performance of Coagulation
Assays; Approved Guideline - 3
Assays; Approved Guideline - 3rdrd Edition (1998). Separated plasma should be stored at +2 to +8 °C Edition (1998). Separated plasma should be stored at +2 to +8 °C
and tested within 4 hours of collection.
and tested within 4 hours of collection.
If the samples are to be frozen before testing, the plasma must double spun to remove platelets
If the samples are to be frozen before testing, the plasma must double spun to remove platelets
(to below 10 x 10
(to below 10 x 1099 /L) /L)1010 prior to freezing as these can shorten the prior to freezing as these can shorten the LA 1 Screening Reagent clottingLA 1 Screening Reagent clotting
time.
time.
Test Procedure
Test Procedure
1.
1. Pre-warm a slight excess of LA 1 Screening Reagent or LA 2 Pre-warm a slight excess of LA 1 Screening Reagent or LA 2 Conrmation Reagent at 37 ± 1 Conrmation Reagent at 37 ± 1 °C°C
in a reagent reservoir, allowing for 200 µL per test.
in a reagent reservoir, allowing for 200 µL per test.
2.
2. Dispense 200 µL of test plasma into a glass test tube and warm for 1 minute at +37 °C.Dispense 200 µL of test plasma into a glass test tube and warm for 1 minute at +37 °C.
3.
3. Add 200 µL of pre-warmed reagent to the plasma and time from the moment of reagent adAdd 200 µL of pre-warmed reagent to the plasma and time from the moment of reagent additiondition
to a clotting end point.
to a clotting end point.
4.
4. Repeat for duplicate test values and report the average of these as the result.Repeat for duplicate test values and report the average of these as the result.
Automated method Automated method
Protocols for Siemens analyzers are available on request.
Protocols for Siemens analyzers are available on request.
LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent tests should be carried out using equal
LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent tests should be carried out using equal
volumes of test plasma and reagent as in most thrombin time protocols. However, observation or
volumes of test plasma and reagent as in most thrombin time protocols. However, observation or
acquisition times should be extended to
acquisition times should be extended to 120 seconds.120 seconds.
Materials provided Materials provided LA 1
LA 1[REAGENT][REAGENT],,[REF][REF] OQGP with OQGP with
10 x
10 xll 2 mL LA 1 2 mL LA 1[REAGENT][REAGENT], LA 1 Screening Reagent, LA 1 Screening Reagent
LA 2
LA 2[REAGENT][REAGENT],,[REF][REF] OQGR with OQGR with
10 x
10 xll 1 mL LA 2 1 mL LA 2[REAGENT][REAGENT], LA 2 Conrmation Reagent, LA 2 Conrmation Reagent
Materials required but not provided Materials required but not provided 10 mm x 75 mm glass test tubes
10 mm x 75 mm glass test tubes
Pipette to deliver 200 µL, 1 mL, 2 mL or 5 mL
Pipette to deliver 200 µL, 1 mL, 2 mL or 5 mL
Water bath, stop watch
Water bath, stop watch
Puried water, USP or equivalent
Puried water, USP or equivalent
LA Control High (
LA Control High ([REF][REF] OQWD) OQWD)
LA Control Low (
LA Control Low ([REF][REF] OQWE) OQWE)
Quality Control Quality Control
Each laboratory should determine its
Each laboratory should determine its own acceptable control values and normal own acceptable control values and normal range.range.
LA Control High (
LA Control High ([REF][REF] OQWD) and LA Control Low ( OQWD) and LA Control Low ([REF][REF] OQWE) are distributed by Siemens for OQWE) are distributed by Siemens for
use in quality control of LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent assays. Quality
use in quality control of LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent assays. Quality
control plasma must be tested at the same time as patient samples.
control plasma must be tested at the same time as patient samples.
Results
Results
If the LA 1 Screening Reagent clotting time is within the normal range, no further testing for LA
If the LA 1 Screening Reagent clotting time is within the normal range, no further testing for LA
may be necessary. If the LA 1 Screening Reagent clotting time result is more than 2 SD longer
may be necessary. If the LA 1 Screening Reagent clotting time result is more than 2 SD longer
than the mean of normal plasma (ideally n ≥ 20), the result should be considered abnormal and
than the mean of normal plasma (ideally n ≥ 20), the result should be considered abnormal and
investigated further. (See gure 1)
investigated further. (See gure 1)
The nal result is best expressed as a ratio of the clotting tim
The nal result is best expressed as a ratio of the clotting times of LA 1 Screening Reagent dividedes of LA 1 Screening Reagent divided
by LA 2 Conrmation Reagent.
by LA 2 Conrmation Reagent.
LA
LA 1 1 Screening Screening Reagent Reagent clotting clotting timetime
LA Ratio =
LA Ratio = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– LA 2 Conrmation Reagent clotting time
LA 2 Conrmation Reagent clotting time
Figure 1 Figure 1 1 1 Mixing tests Mixing tests
If results are borderline, mixing studies may be used to correct for hidden defects in the sample
If results are borderline, mixing studies may be used to correct for hidden defects in the sample
and clarify the presence of LA. These tests should be carried out on a 50:50 mixture of test plasma
and clarify the presence of LA. These tests should be carried out on a 50:50 mixture of test plasma
and normal plasma (Siemens Control Plasma N should not be used for mixing studies) using the
and normal plasma (Siemens Control Plasma N should not be used for mixing studies) using the
standard test procedure.
standard test procedure.
TABLE 1: Combination of mixing and
TABLE 1: Combination of mixing and conrmatory testsconrmatory tests L
LAA11 LLAA22 DiagnosisDiagnosis
Pa
Patitienent Plt Plasasmama MixMix-
-Patient + Normal
Patient + Normal PaPatitienent Plast Plasmama MixMixPatient + NormalPatient + Normal-
-N
N NN NN NN LA not detectedLA not detected
A ABBNN AABBNN NN NN LLAApprreesseenntt A ABBNN NN AABBN N NN FFaaccttoor r ddeecciieenntt//OOAATT A ABBNN AABBNN AABBNN NN LLA A + + FFaaccttoor r ddeecciieenntt A ABBNN AABBNN AABBNN AABBNN OOtthheer r iinnhhiibbiittoorr
Calculating a normalized ratio may be useful to correct for differences in instrument/reagent com
Calculating a normalized ratio may be useful to correct for differences in instrument/reagent com- -binations. Normalization uses the mean clot times of normal plasma tested with LA 1 Screening
binations. Normalization uses the mean clot times of normal plasma tested with LA 1 Screening
Reagent and LA 2 Conrmation Reagent in the users own laboratory. This may improve discrimina
Reagent and LA 2 Conrmation Reagent in the users own laboratory. This may improve discrimina- -tion between normal and low positive LA samples.
tion between normal and low positive LA samples.
patient
patient LA LA 1 1 Screening Screening Reagent Reagent mean mean normal normal LA LA 2 2 Conrmation Conrmation ReagentReagent Normalized
Normalized Ratio Ratio = = mean mean ––––––––––––––––––––––––––––––normal normal LA LA 1 1 –––––––––––––––– –––––––––––––––– Screening Screening Reagent Reagent x x ––––––––––––––––––––––––––––––––patient patient LA LA 2 2 Conrmation Conrmation ––––––––––––––––––––––––––––––––ReagentReagent ––
The ow chart in gure 1 can also be used to interpret normalized ratios.
The ow chart in gure 1 can also be used to interpret normalized ratios.
Limitations of the Procedure
Limitations of the Procedure
Samples containing clots and those with abnormal hematocrits should be discarded. Jaundiced,
Samples containing clots and those with abnormal hematocrits should be discarded. Jaundiced,
lipemic and hemolysed specimens should be tested by manual techniques as some photo-electric
lipemic and hemolysed specimens should be tested by manual techniques as some photo-electric
instruments give false results.
instruments give false results.
Commercially available normal quality control
Commercially available normal quality control plasmas with unspecied levels of citrate and plateplasmas with unspecied levels of citrate and plate- -lets are not recommended for use in mixing studies.
lets are not recommended for use in mixing studies.
For comparative studies LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent tests should be
For comparative studies LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent tests should be
performed at the same time.
performed at the same time.
At least 2 screening tests based on different assay principles should be performed
At least 2 screening tests based on different assay principles should be performed. . Additionally aAdditionally a
mixing study for the verication of the presence of
mixing study for the verication of the presence of a coagulation inhibitor and a conrmation test fora coagulation inhibitor and a conrmation test for
the documentation of phospholipid dependency should be performed
the documentation of phospholipid dependency should be performed1010..
Heparin levels up to 1 unit/mL have no effect due to the presence of a neutralizing agent in both LA 1
Heparin levels up to 1 unit/mL have no effect due to the presence of a neutralizing agent in both LA 1
Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent.
Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent.
Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient’s medical history,
Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient’s medical history,
clinical presentation and other ndings.
clinical presentation and other ndings.
Expected Values
Expected Values
Normal ranges for LA 1 Screening Reagent of 31 -
Normal ranges for LA 1 Screening Reagent of 31 - 44 seconds and for LA 2 Conrmation Reagent44 seconds and for LA 2 Conrmation Reagent
of 30 - 38 seconds were obtained using
of 30 - 38 seconds were obtained using a manual tilt-tube method with samples colla manual tilt-tube method with samples collected from 26ected from 26
healthy individuals aged 18 to 55 years. The ratio of LA
healthy individuals aged 18 to 55 years. The ratio of LA 1 / LA 2 was in 1 / LA 2 was in the range 0.8 - 1.2. Thesethe range 0.8 - 1.2. These
results should be used as a guide only.
results should be used as a guide only.
LA
LA 1 1 ScreeningScreening If ratio
If ratio ––––––––––––– ––––––––––––– LA LA 2 2 ConrmConrm is greater is greater than 2.0, than 2.0, LA is strongly LA is strongly present,present,
LA
LA 1 1 ScreeningScreening If ratio
If ratio ––––––––––––– ––––––––––––– LA LA 2 2 ConrmConrm is between 1.5 is between 1.5 and 2.0, LA and 2.0, LA is moderately present,is moderately present,
LA
LA 1 1 ScreeningScreening If ratio
If ratio ––––––––––––– ––––––––––––– LA LA 2 2 ConrmConrm is between 1.2 is between 1.2 and 1.5, LA and 1.5, LA is weakly present,is weakly present,
Each laboratory should determine its own normal range for both manual and automated methods
Each laboratory should determine its own normal range for both manual and automated methods
to overcome differences in sample collection and instrumentation.
to overcome differences in sample collection and instrumentation.
OQGP G17 C0501 (799) OQGP G17 C0501 (799)
OQGP G17 C0501 (799) 2
Specic Performance Characteristics
Intra-laboratory and inter-laboratory precision studies were performed using both manual tilt-tube and automated methods. These studies gave coefcient of variation less than 3.5 % on normal plasmas and less than 5 % for abnormal samples.
Specicity Studies were performed on known plasma samples.
A positive ratio for LA 1 Screening Reagent/LA 2 Conrmation Reagent of greater than 1.2 was found in known*:
LA plasma- 90 % (26/29) Heparinized plasma- 12 % (1/8) OAT patient plasma- 0 % (0/7) Factor decient plasma- 0 % (0/5) Normal plasma- 2 % (1/60)
* N.B. “known” LA identication with APTT + KCT mixing studies.
Bibliography
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in systemic lupus erythematosis (SLE) and in non-SLE disorders. Ann. Intern. Med. 1990, 112, 682-698
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7. Exner T, Papadopoulos G, Koutts J Use of a simplied dilute Russell’s viper venom time (DRV -VT) conrms heterogeneity among ”lupus anticoagulants”. Blood Coag. Fibrinol. 1990, 1, 259-266
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9. Galli M., Finazzi G, Bevers EM, Barbui T. Kaolin clotting time and dilute Russel’s viper venom time distinguish between prothrombin dependent and beta-2-glycoprotein 1 dependent an -tiphospholipid antibodies. Blood. 1995, 86, 617-623
10. Brandt JT, Triplett DA, Alving B, Scharrer I, Criteria for the Diagnosis of Lupus Anticoagulants: An Update. Thromb. Haemostas. 1995, 74 (4), 1185-90
Edition October 2008
Screening-Reagenz LA 1 /
Bestätigungsreagenz LA 2
LA 1
[REAGENT]
/
LA 2
[REAGENT]
Vereinfachtes “Dilute Russell’s Viper Venom Time” (DRVVT, Schlangengiftaktivator)-Reagenz zum Nachweis von Lupus Anticoagulans
Anwendungsbereich
Screening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 sind vereinfachte DRVVT-Reagenzien zum Nachweis von Lupus Anticoagulans (LA) in einstugen Gerinnungstests.
Screening-Reagenz LA 1
Vereinfachtes DRVV-Reagenz zum Screening auf Lupus Anticoagulans. Bestätigungsreagenz LA 2
Phospholipidreiches DRVV-Reagenz für die spezische K orrektur von Lupus Anticoagulans.
Diagnostische Bedeutung
Bei Lupus Anticoagulans (LA) handelt es sich um Auto-Antikörper gegen negativ geladene Phos -pholipide oder Komplexe von Phos-pholipiden mit entweder Beta-2-Glykoprotein 1 oder Gerinnungs -faktoren wie Prothrombin. Sie treten bei verschiedenen klinischen Zuständen, insbesondere jedoch bei Autoimmunerkrankungen auf1. Darüber hinaus wird LA heute als signikanter Risikofaktor für
Patienten mit anderweitig nicht zu erklärenden Thrombosen angesehen und ist häug bei Frauen mit wiederholten Fehlgeburten nachzuweisen5. LA wird üblicherweise mit phospholipid-empnd
-lichen Gerinnungstests wie APTT (activated partial thromboplastin time), KCT (kaolin clotting time), und DRVVT2 nachgewiesen, bei denen es gerinnungshemmend wirkt.
Die DRVV-Zeit begann sich nach der Publikation von Thiagarajan et al. im Jahre 1986 durchzuset -zen6. Diese Methode wurde vereinfacht und standardisiert7. Nach Petri8 et al. ist bei
Thrombose-Patienten mit systemischem Lupus erythematodes die Wahrscheinlichkeit höher, LA mit DRVVT nachzuweisen mit einem Enzymimmunoassay (ELISA)5 für Antikardiolipin-Antikörper . Diese
Beobachtung wurde kürzlich durch Galli und Bevers9 erweitert, die gezeigt haben, dass der
LA-Subtypus mit der größten Wirkung auf DRVVT-Tests auf Beta-2-Glykoprotein 1 angewiesen ist und sich vom Prothrombin-abhängigen LA-Subtypus unterscheidet, der sich eher verlängernd auf KCT-Tests auswirkt.
Prinzip der Methode
1. Das im Screening-Reagenz LA 1 enthaltene Gift der Russel Viper löst die Plasmagerinnung durch direkte Aktivierung des Faktor X aus. Die LA-Antikörper verlängern die Gerinnungszeit des Screening-Reagenz’ LA 1.
2. Das Bestätigungsreagenz LA 2 ähnelt dem Screening-Reagenz LA1, enthält aber eine höhere Konzentration an Phospholipiden. Diese zusätzlichen Phospholipide wirken dem LA-Antikörper entgegen und korrigieren so weitestgehend die Gerinnungszeit3.
3. Der DRVVT-Test umgeht Faktor VII des extrinsischen Systems der Blutgerinnung sowie die Kontakt- und antihämophilen Faktoren des intrinsischen Systems. Deshalb ist das Screening-Reagenz LA 1 für den spezischen Nachweis von LA besser geeignet als APTT-Tests, denn es wird weder durch Kontaktfaktor-Anomalien noch durch einen Faktor-VIII-Mangel oder An -tikörper beeinusst6. Es wurden eine Reihe von Tests auf Basis der Phospholipid-Korrektur4
entwickelt, es hat sich allerdings keiner als annähernd so geeignet erwiesen, wie der Einsatz des Bestätigungs-Reagenz‘ LA 2 im Anschluss an das Screening-Reagenz LA 1.
4. Um einen Mangel an den Faktoren II, V und X auszuschließen, der das Testergebnis mit dem Screening-Reagenz LA 1 und dem Bestätigungsreagenz LA 2 verlängern würde, können auch Plasmatauschversuche nützlich sein. Durch Mischen von normal em Plasma mit Testplasma wer
-den die im Testplasma fehlen-den Faktoren wieder zugeführt. Wenn der Plasmatauschversuch noch immer zu verlängerten Testzeiten führt, ist dies ein Hinweis darauf, dass sich im Testplas
-ma ein Inhibitor (wie LA) bendet. Nor-malerweise weist eine verlängerte Gerinnungszeit, die auch durch Mischen von Patientenplasma mit normalem Plasma nicht korrigiert wird, auf einen zirkulierenden Inhibitor hin3, 10.
Reagenzien
ZusammensetzungScreening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 enthalten das Gift der Russell Viper, Phospholipide, Antiheparin-Wirkstoffe, Calcium, Pufferlösung, Stabilisatoren, Natriumazid und Farb-stoffe.
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen Nur zurin-vitro diagnostischen Anwendung.
Bei Entsorgung ins Abwasser mit viel Wasser nachspülen, um die Bildung explosiver Stoffe in Metall-Abussrohren zu verhindern.
Vorbereitung der Reagenzien
Den Inhalt des Fläschchens mit der auf dem Etikett angegebenen Menge destilliertem Wasser auösen. Den Inhalt durch Umschütteln sorgfältig mischen, um vollständige Resuspendierung des lyophilisierten Materials zu gewährleisten.
Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Wenn die gefriergetrockneten Reagenzien bei +2 bis +8 °C aufbewahrt werden, sind sie mindes -tens bis zu dem auf dem Flaschenetikett aufgedruckten Datum haltbar.
Nach Rekonstitution können die Reagenzien bei +37 °C 8 Stunden, bei +20 bis +25 °C 24 Stunden, bei +2 bis +8 °C 48 Stunden und bei -20 °C einen Monat lang gelagert werden.
Anzeichen für Instabilität und Verfall
Wenn beim Öffnen des Fläschchens keine deutlichen Anzeichen von Vakuum festzustellen sind und/oder wenn das Reagenz nicht trocken wirkt, sollte dieses an Siemens Healthcare Diagnostics zurückgesendet werden.
Probenabnahme und -vorbereitung
Das Blut ist gemäß dem NCCLS-Standard H21-A3 über Abnahme, Transport und V erarbeitung von Blutproben für Gerinnungstests und die Allgemeine Durchführung von Gerinnungsassays - aner -kannte Richtlinie - 3.Ausgabe (1998), abzunehmen und zu verarbeiten. Abgetrenntes Plasma ist bei +2 bis +8 °C z u lagern und innerhalb von 4 Stunden nach Entnahme zur Testung einzusetzen. Wenn die Proben vor der Austestung eingefroren werden sollen, muss das Plasma vor dem Einfrie -ren zweimal zentrifugiert werden, um Blutplättchen (auf weniger als 10 x 109 /l)10 zu entfernen, denn
diese können sonst die Gerinnungszeit des S creening Reagenz‘ LA 1 verkürzen.
Testdurchführung
1. In einem Reagenzglas, das mindestens 200 µl pro Test aufnehmen kann, etwas mehr als die benötigte Menge Screening-Reagenz LA 1 und/oder Bestätigungsreagenz LA 2 bei +37 °C ± 1 °C vorwärmen.
2. 200 µl Patientenplasma in ein Glasgefäß geben und 1 Minute bei +37 °C inkubieren. 3. 200 µl vorgewärmtes Screening-Reagenz LA 1 oder Bestätigungsreagenz LA 2 zum Plasma
geben und die Zeit von der Zugabe des Reagenzes bis zum Abschluss der Gerinnungsreaktion messen.
4. Test für Doppelbestimmung wiederholen und Mittelwert der Testresultate bilden. Automatisierte Methode
Testvorschriften für Siemens-Analysatoren stehen auf Anfrage zur Verfügung.
Die Tests mit Screening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 sollten, wie auch in den meisten Thrombin-Zeit-Protokollen, unter Verwendung gleicher Volumina an Testplasma und Rea-genz ausgeführt werden. Die Messwertaufnahme- bzw. Auswertezeit sollte jedoch auf 120 Sekun -den ausgedehnt wer-den.
Inhalt der Handelspackung LA 1[REAGENT],[REF]OQGP mit
10 xl 2 ml LA 1[REAGENT], Screening-Reagenz LA 1
LA 2[REAGENT],[REF] OQGR mit
10 xl 1 ml LA 2[REAGENT], Bestätigungsreagenz LA 2
Zusätzlich benötigte Materialien 10 mm x 75 mm Reagenzgefäße, Pipette für 200 µl, 1 ml, 2 ml oder 5 ml Wasserbad, Stoppuhr
destilliertes Wasser (USP oder vergleichbare Reinheit) LA Kontrolle Hoch ([REF] OQWD)
LA Kontrolle Niedrig ([REF] OQWE) Qualitätskontrolle
Jedes Labor sollte seine eigenen Vertrauensbereiche der Kontrollen und einen Normalbereich festlegen.
LA Kontrolle Hoch ([REF] OQWD) und LA Kontrolle Niedrig ([REF] OQWE) werden von Siemens zur Qualitätskontrolle von Screening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 geliefert. Die Bestim -mungen der Kontrollplasmen und Patientenproben müssen gleichzeitig durchgeführt werden.
Ergebnisse
Wenn die LA 1-Gerinnungszeit im Normalbereich liegt, ist möglicherweise keine weitere Testung auf LA notwendig. Wenn die LA 1-Gerinnungszeit über 2 SD oder etwa 20 % länger als der Mittel-wert des Normalplasmas (idealerweise n ≥ 20) ist, sollte das Ergebnis als nicht normal betrachtet werden und weiter untersucht werden (siehe Abbildung 1).
Das Endergebnis lässt sich am besten als Verhältnis (Ratio) zwischen der Gerinnungszeit des Screening-Reagenz LA 1 und der Gerinnungszeit des Bestätigungsreagenz LA 2 ausdrücken.
Gerinnungszeit Screening-Reagenz LA 1 LA Ratio = ––––––––––––––––––––––––––––––––––
Gerinnungszeit Bestätigungsreagenz LA 2 Abbildung 1
Plasmatauschversuch
Um versteckte Fehlergebisse der Probe zu korrigieren und um die Präsenz von LA zu klären, können bei grenzwertigen Ergebnissen Plasmatauschversuche durchgeführt werden. Bei diesen Tests, die wie der normale Standardtest durchzuführen sind, sollte das Verhältnis zwischen der Plasmaprobe und dem normalen Plasma 50:50 betragen (für Plasmatauschversuche sollte nicht Siemens Control Plasma N verwendet werden).
Tabelle 1: Kombination von Plasmatauschversuchen und Bestätigungstests
LA1 LA2 Diagnose
Patienten-plasma MischungPatient + Normal
Patienten-plasma MischungPatient + Normal
N N N N KeinNachweis
von LA
ABN ABN N N NachweisvonLA
ABN N ABN N Faktormangel/OAT
ABN ABN ABN N LA + Faktormangel
ABN ABN ABN ABN Sonstiger Inhibitor
Zum Ausgleich der A bweichungen bei verschiedenen Kombinationen von Reagenzien bzw. Gerä -ten kann die Berechnung einer normalisier-ten Verhältniszahl sinnvoll sein. Bei der Normalisierung werden die mittleren Gerinnungszeiten des im Labor des Anwenders mit Screening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 getesteten Normalplasmas verwendet. Das kann die Unterschei -dung zwischen normalen und schwach positiven LA- Proben erleichtern.
Screening-Reagenz LA 1 Patient mittlere Normalzeit Bestätigungsreagenz LA2 Normalisierte Ratio = ––––––––––––––––––––––––––––––– mittlere Normalzeit Screening Reagenz LA 1 x ––––––––––––––––––––––––––––––––––Bestätigungsreagenz LA 2 Patient
Zur Interpretation normalisierter Verhältniszahlen kann das Flussdiagramm in Abbildung 1 eben -falls herangezogen werden.
Einschränkungen der Testdurchführung
Proben mit bereits vorhandenen Gerinnseln und abnormen Hämatokritwerten sollten verworfen werden. Hepatische, lipämische und hämolytische Proben sollten mit manuellen Verfahren getestet werden, da einige photometrische Instrumente falsche Resultate liefern.
Die Verwendung von kommerziell erhältlichen Kontrollplasmen, die keine Angabe zu Citrat- und Plättchenkonzentrationen machen, ist nicht zu empfehlen.
Bei Vergleichsprüfungen sollten die Tests mit Screening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 jeweils zur gleichen Zeit durchgeführt werden.
Es sollten mindestens 2 auf unterschiedlichen Testprinzipien basierende Screening-Tests durchge-führt werden. Darüber hinaus sollte ein Plasmatauschversuch zur Verikation des Vorhandenseins eines Gerinnungshemmers und ein Bestätigungstest zur Dokumentation der Phospholipid-Abhän -gigkeit durchgeführt werden10.
Heparin-Konzentrationen bis 1 Einheit/ml haben keine Auswirkungen, denn sowohl Screening-Reagenz LA 1 als auch Bestätigungsreagenz LA 2 enthalten entsprechende Neutralisatoren. Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem kli -nischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden.
Erwartete Werte
Mit Proben von 26 gesunden Personen im Alter zwischen 18 und 55 Jahren wurden bei Anwendung einer manuellen Methode für das Screening-Reagenz LA 1 ein Normalbereich von 31 - 44 Sekunden und für das Bestätigungsreagenz LA 2 ein Normalbereich von 30 - 38 Sekunden gefunden. Die Ratio von LA 1 : LA 2 bewegte sich im Bereich zwischen 0,8 und 1,2. Diese Ergebnisse bieten lediglich einen Anhaltspunkt.
Screening LA 1
Ist das Verhältnis –––––––––––––– größer als 2,0, dann ist LA stark ausgeprägt.
Bestätigung LA 2 Screening LA 1
Ist das Verhältnis –––––––––––––– zwischen 1,5 und 2,0, dann ist LA mäßig ausgeprägt.
Bestätigung LA 2 Screening LA 1
Ist das Verhältnis –––––––––––––– zwischen 1,2 und 1,5, dann ist LA schwach ausgeprägt.
Bestätigung LA 2
Jedes Labor sollte seinen eigenen Normalbereich sowohl für manuelle als auch automatisierte Testmethoden bestimmen, um Unterschiede bei Probennahme und Geräten auszugleichen.
Leistungsmerkmale des Tests
Intra- und Interlaboratoriumsstudien zur Präzision wurden sowohl mit manuellen (tilt tube) als auch automatisierten Methoden durchgeführt. Diese Prüfungen ergaben Variationskoefzienten von we-niger als 3,5 % bei normalen Plasmen und wewe-niger als 5 % bei abnormen Proben.
Untersuchungen zur Spezität wurden an bekannten Plasmaproben durchgeführt.
Bei folgenden Plasmen* wurde zwischen S creening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 eine positive Ratio von größer als 1,2 gefunden:
LA-Plasma 90 % (26/29)
heparinisiertes Plasma 12 % (1/8) Plasma von OAT-Patienten 0 % (0/7) Plasma mit Faktormangel 0 % (0/5)
Normalplasma 2 % (1/60)
* Bei diesen Plasmen wurde LA in APTT+KCT-Plasmatauschversuchen nachgewiesen.
Literatur
Siehe englische Packungsbeilage.
Ausgabe Oktober 2008
LA 1 Réactif de dépistage /
LA 2 Réactif de conrmation
LA 1
[REAGENT]
/
LA 2
[REAGENT]
Test simplié de mesure du Temps de Venin de Vipère Russell dilué (dRVVT, activateur de venin de serpent), pour le dépistage des anticoagulants lupiques
Domaine d’utilisation
Les réactifs LA 1 de dépistage et LA 2 de conrmation sont des réactifs dRVVT simpliés, qui permettent la mise en évidence d’anticoagulants lupiques (LA) dans des tests de coagulation en
LA 1 Réactif de dépistage
Réactif dRVV simplié pour le dépistage des anticoagulants lupiques. LA 2 Réactif de conrmation
Réactif dRVV riche en phospholipides, pour la correction spécique des anticoagulants lupiques.
Intérêt diagnostique
Les anticoagulants lupiques (LA) sont des auto-anticorps dirigés contre des phospholipides char -gés négativement ou des complexes de phospholipides contenant soit de la beta-2-glycoprotéine 1, soit un facteur de la coagulation comme la prothrombine. Ils apparaissent dans différents ta -bleaux cliniques, et plus particulièrement dans les maladies auto-immunes1. Par ailleurs, les LA
sont aujourd’hui considérés comme un facteur de risque signicatif chez les patients souffrant de thromboses inexpliquées, et sont fréquemment mis en évidence chez les femmes ayant eu des avortements répétés5. Les LA sont généralement mis en évidence à l’aide de tests de coagulation
sensibles aux phospholipides où ils agissent en tant qu’inhibiteur de la coagulation, comme le TCA (Temps de Céphaline avec Activateur), le TCK (Temps de Céphaline Kaolin), ou le dRVVT2.
Le dRVVT a commencé à être utilisé après la publication de Thiagarajan et al. en 19866. Cette
méthode a été standardisée et simpliée7. Selon Petri8 et al., la probabilité, chez les patients throm
-botiques souffrant d’un Lupus érythémateux systémique, est plus élevée de révéler des LA avec le dRVVT que des anticorps anti-cardiolipine avec un test immunoenzymatique (ELISA)5. Cette
observation a récemment été élargie par Galli et Bevers9, qui ont montré que le sous-type des LA
ayant le plus d’effet sur le dRVVT est beta-2-glycoprotéine 1 dépendant, et différent du sous-type LA prothrombine dépendant qui a un effet d’allongement plus marqué sur le TCA.
Principe de la méthode
1. Le venin de vipère Russell contenu dans le Réactif de dépistage LA 1 déclenche la coagulation du plasma par activation directe du Facteur X. Les anticorps anti-LA allongent le temps de coagulation du Réactif de dépistage LA 1.
2. Le Réactif de conrmation LA 2 ressemble au Réactif de dépistage LA 1, mais sa concentration en phospholipides est augmentée. Ces phospholipides supplémentaires contrecarrent l’action des anticorps anti-LA et corrigent ainsi largement le temps de coagulation3.
3. Le dRVVT contourne le Facteur VII de la voie extrinsèque de la coagulation ainsi que les fac -teurs de la phase contact et les fac-teurs anti-hémophiliques de la voie intrinsèque. Aussi le Réactif de dépistage LA 1 est-il plus adapté pour la mise en évidence spécique des LA que le TCA, car il n’est inuencé ni par des anomalies des facteurs de la phase contact, ni par un décit en Facteur VIII, ni par des anticorps6. Une série de tests basés sur la correction par les
phospholipides4 ont été mis au point. Aucun ne s’est cependant révélé aussi simple d’utilisation
que le Réactif de dépistage LA 1, suivi du Réactif de conrmation LA 2.
4. Pour exclure un décit en Facteur II, V ou X , qui pourrait allonger le résultat obtenu avec le Réactif de dépistage LA 1 et le Réactif de conrmation LA 2, il peut être util e d’effectuer un test de mélange. Pour cela, mélanger le plasma testé avec un plasma témoin, de façon à réintroduire les facteurs manquants dans le plasma testé. Si le mélange donne toujours un temps allongé, cela signie que le plasma testé contient un inhibiteur de la coagulation (par ex. des LA). Nor -malement, un temps de coagulation allongé qui ne se corrige pas par le test de mélange prouve la présence d’un inhibiteur circulant3, 10.
Réactifs
CompositionLe Réactif de dépistage LA 1 et le Réactif de conrmation LA 2 contiennent du venin de vipère Russell, des phospholipides, des agents anti-hépariniques, du calcium, une solution tampon, des stabilisateurs, de l’azide de sodium, et des colorants.
Mises en garde et précautions d’emploi
Les réactifs sont réservés à un usage de diagnosticin-vitro .
En cas d’évacuation dans l’évier, rincer avec un grand volume d’eau pour éviter tout mélange explosif dans les canalisations métalliques.
Préparation des réactifs
Reconstituer le contenu d’un acon avec le volume d’eau distillée indiqué sur l’étiquette. Bien mé -langer en agitant avec précaution an d’assurer une parfaite reconstitution du lyophilisat. Stabilité et conditions de conservation
Les réactifs lyophilisés conservés à +2/+8 °C peuvent être utilisés jusqu’à la date indiquée sur l’étiquette du acon.
Une fois reconstitués, ils se conservent 8 heures à +37 °C, 24 heures à +20/+25 °C, 48 heures à +2/+8 °C et un mois à -20 °C.
Signes d’instabilité et de détérioration
Si, à l’ouverture du acon, on observe une absence de v ide, et/ou si le réactif ne paraît pas l yophi -lisé, le retourner à Siemens Healthcare Diagnostics.
Prélèvement et préparation des échantillons
Prélever et préparer les échantillons selon le NCCLS H21-A3 « Prélèvement, transport et prépara -tion des échantillons sanguins pour tests de coagula-tion », ainsi que selon la procédure générale pour tests de coagulation, directive validée, 3ème édition (1998). Conserver le plasma séparé à
+2/+8 °C, et le tester dans les 4 heures qui suivent le prélèvement.
Si les plasmas doivent être congelés avant leur utilisation dans le test, les centrifuger deux fois pour éliminer les plaquettes sanguines (le taux doit être inférieur à 10 x 109 /l)10 car celles-ci peuvent
raccourcir le temps de coagulation du Réactif de dépistage LA 1.
Réalisation du test
1. Dans un acon pour réactif pouvant contenir au moins 200 µl par test, préchauffer à +37 ± 1 °C un peu plus que la quantité nécessaire de Réactif de dépistage LA 1 et/ou de Réactif de conr -mation LA 2.
2. Distribuer 200 µl de plasma de patient dans un tube à essai en verre, et laisser incuber 1 minute à +37 °C.
3. Ajouter au plasma 200 µl de Réactif de dépistage LA 1 ou de Réactif de conrmation LA 2 préchauffé, et mesurer le temps écoulé depuis l’addition du Réactif jusqu’à l a n de la réaction de coagulation.
4. Répéter la mesure pour un dosage en double, et calculer la moyenne des résultats obtenus. Méthode automatisée
Les protocoles de test sur les automates Siemens sont disponibles sur demande.
Les tests utilisant le Réactif de dépistage LA 1 et le Réactif de conrmation LA 2 doivent, comme la plupart des tests de mesure du temps de thrombine, être effectués avec un volume égal de plasma de patient et de réactif. Cependant, le temps de lecture ou d’exploitation doit être porté à 120 secondes.
Conditionnements
LA 1[REAGENT],[REF] OQGP contenant
10 xl 2 ml LA 1[REAGENT], LA 1 Réactif de dépistage
LA 2[REAGENT],[REF] OQGR contenant
10 xl 1 ml LA 2[REAGENT], LA 2 Réactif de conrmation
Matériel nécessaire
Tubes à essai en verre de 10 mm x 75 mm Pipette pour distribuer 200 µl, 1 ml, 2 ml ou 5 ml Bain-marie, chronomètre
Eau distillée (USP ou de pureté équivalente) LA Contrôle Elevé ([REF] OQWD) LA Contrôle Bas ([REF] OQWE)
OQGP G17 C0501 (799) 4 Contrôle de qualité
Il est recommandé à chaque laboratoire de déterminer ses propres domaines de conance pour les contrôles et son propre domaine normal.
Le LA Contrôle Elevé ([REF] OQWD) et le LA Contrôle Bas ([REF] OQWE) sont proposés par Sie -mens pour le contrôle de qualité du Réactif de dépistage LA 1 et du Réactif de conrmation LA 2.
Résultats
Si le temps de coagulation de LA 1 est trouvé à l’intérieur du domaine normal, il n’est éventuel -lement pas nécessaire d’effectuer un autre test de LA. Si le temps de coagulation de LA 1 est supérieur à 2 DS ou allongé d’environ 20 % par rapport à la valeur moyenne d’un plasma normal (idéalement n ≥ 20), le résultat doit être considéré comm e anormal, et des tests complémentaires doivent être effectués (cf. Schéma 1).
Le mieux est d’exprimer le résultat nal en ratio : temps de coagulation du Réactif de dépistage LA 1/temps de coagulation du Réactif de conrmation LA 2.
Temps de coagulation du Réactif de dépistage LA 1 Ratio LA = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Temps de coagulation du Réactif de conrmation LA 2 Schéma 1
1
Test de mélange
En cas de résultat douteux, effectuer un test de mélange pour corriger l’éventuel faux résultat ob -tenu et clarier la présence de LA. Pour cela, mélanger à parts égales le plasma du malade avec un plasma normal dit plasma témoin, et tester le mélange selon la procédure normale du test (comme plasma témoin, ne pas utiliser le Siemens Plasma de contrôle N).
Tableau 1 : Combinaisons des tests de mélange et des tests de conrmation
LA1 LA2 Diagnostic
Plasma du
malade Mélangemalade + témoin Plasma dumalade Mélangemalade + témoin
N N N N Pasdemiseen
évidence de LA
ABN ABN N N Miseenévidence
de LA
ABN N ABN N Facteur décient/
AVK
ABN ABN ABN N LA+facteur
décient
ABN ABN ABN ABN Autre inhibiteur
An de corriger les variations de résultats obtenus selon les réactifs et l’appareil utilisés, il est recommandé de calculer un ratio normalisé. Pour cela, utiliser les temps de coagulation moyens obtenus dans le laboratoire avec le Réactif de dépistage LA 1 et le Réactif de conrmation LA 2 sur un plasma normal. Ceci peut faciliter la différenciation entre des échantillons normaux et des échantillons faiblement positifs en LA.
Temps du malade avec Réactif de dépistage LA 1 Ratio normalisé = ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Temps moyen du témoin avec Réactif de dépistage LA 1 X
Temps moyen du témoin avec Réactif de conrmation LA 2
––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Temps du malade avec Réactif de de conrmation LA 2
Pour l’interprétation du ratio normalisé ont peut également suivre le diagramme représenté selon le schéma 1.
Limites de réalisation du test
Ne pas utiliser d’échantillons ayant déjà coagulés ou avec un hématocrite anormal. Les échan -tillons hépatiques, lipémiques ou hémolytiques doivent être testés en méthode manuelle, car cer -tains appareils photométriques fournissent des résultats erronés.
Il n’est pas recommandé d’utiliser des plasmas de contrôle du commerce dont les concentrations en citrate et en plaquettes ne sont pas précisées.
Les tests effectués dans le cadre d’études comparatives avec les Réactifs de dépistage LA 1 et de conrmation LA 2 doivent être effectués simultanément.
Effectuer au moins 2 tests de dépistage basés sur des principes de test différents. Par ailleurs, effectuer un test de mélange pour vérier la présence d’un inhibiteur de la coagulation, et un test de conrmation pour vérier la sensibilité aux phospholipides10.
Les concentrations d’héparine jusqu’à 1 unité/ml n’ont pas d’inuence sur les tests, c ar aussi bien le Réactif de dépistage LA 1 que le Réactif de conrmation LA 2 contiennent un neutralisateur correspondant.
Les résultats de ce test doivent toujours être interprétés en rapport avec les antécédents médicaux du patient, les signes cliniques et autres constatations.
Valeurs attendues
Les échantillons de 26 sujets sains âgés de 18 à 55 ans testés en méthode manuelle ont donné un domaine normal compris entre 31 et 44 secondes avec le Réactif de dépistage LA 1, et un domaine normal compris entre 30 et 38 secondes avec le Réactif de conrmation LA 2. Le ratio LA 1/LA 2 s’étend sur un domaine compris entre 0,8 et 1,2. Ces valeurs ne sont données qu’à titre indicatif.
Dépistage LA1
Si le ratio –––––––––––––– est supérieur à 2,0, la présence de LA est fortement marquée Conrmation LA 2
Dépistage LA1
Si le ratio –––––––––––––– est compris entre 1,5 et 2,0, la présence de LA est moyenne Conrmation LA 2
Dépistage LA1
Si le ratio –––––––––––––– est compris entre 1,2 et 1,5, la présence de LA est faible Conrmation LA 2
Chaque laboratoire doit déterminer son propre domaine normal, aussi bien pour la méthode ma -nuelle que pour les méthodes avec automates, pour corriger les variations dues au prélèvement des échantillons et à l’automate utilisé.
Caractéristiques du test
Des études de précision intra et inter-laboratoires ont été effectuées, en méthode manuelle (retour -nement du tube) et sur automates. Les coefcients de variation obtenus étaient inférieurs à 3,5 % pour les plasmas normaux, et inférieurs à 5 % pour les échantillons anormaux.
Des études de spécicité ont été effectuées sur des échantillons plasmatiques connus. Un ratio positif entre Réactif de dépistage LA 1 et Réactif de conrmation LA 2 supérieur à 1,2 a été trouvé sur les plasmas connus suivants :
Plasmas LA positifs 90 % (26/29) Plasmas héparinés 12 % (1/8) Plasmas de patients sous AVK 0 % (0/7) Plasmas avec facteur décient 0 % (0/5) Plasmas normaux 2 % (1/60)
* l’identication des LA s’est faite par TCA + TCK sur plasma mélangé
Littérature
Cf. texte anglais. Edition Octobre 2008LA 1 Reagente di screening /
LA 2 Reagente di conferma
LA 1
[REAGENT]
/
LA 2
[REAGENT]
Reagente semplicato per il tempo di Veleno di Vipera Russell Diluito (DRVVT) per l’identicazione degli Anticoagulanti Lupus
Uso previsto
Il Reagente di screening LA 1 e il Reagente di conferma LA 2 sono reagenti DRVVT per l’identi -cazione degli anticoagulanti lupici (LA) nei test di coagulazione ad una fase.
LA 1 Reagente di screening
Reagente DRVV semplicato per lo screening degli anticoagulanti lupici. LA2 Reagente di Conferma
Reagente DRVV ricco di fosfolipidi per la correzione specica degli anticoagulanti lupici.
Signicato diagnostico
Gli anticoagulanti lupici (LA) sono degli autoanticorpi diretti contro i fosfolipidi con carica negativa o i complessi di fosfolipidi con beta-2-glicoproteina 1 o fattori della coagulazione, quali la protrombina. Essi si riscontrano in varie condizioni cliniche, specialmente nelle malattie autoimmuni1. Inoltre gli
LA sono da considerarsi come un fattore di rischio signicativo nei pazienti con inspiegabili trombosi e sono spesso presenti in donne con aborti ricorrenti5. Normalmente gli LA vengono individuati
attraverso test coagulativi sensibili ai fosfolipidi, come l’aPTT (Tempo di Tromboplastina Parziale at
-tivato), tempo di coagulazione con caolino (KCT) e DRVVT2, dove hanno un effetto anticoagulante.
Il tempo di DRVV divenne popolare in seguito alla pubblicazione di Thiagarajan et al. nel 19866.
Questo metodo è stato standardizzato e semplicato7. Secondo Petri8 et al., la trombosi nei pazienti
SLE è maggiormente collegata agli LA identicabili con DRVVT che con gli anticorpi anti-cardioli -pina identicati da test immunoenzimatico (ELISA)5. Questa osservazione è stata recentemente
spiegata da Gall e Bevers9, i quali hanno dimostrato che il sottotipo LA con m aggiore effetto sui test
DRVVT è dipendente dalla beta-2-glicoproteina, e diverso dal sottotipo LA richiedente protrombina, che ha un effetto prolungato sui test K CT.
Principio del metodo
1. Il veleno di vipera Russell, presente nel Reagente di screening LA 1 attiva direttamente il fattore X, provocando la coagulazione del plasma. Gli anticorpi LA allungano il tempo di coagulazione del Reagente di screening LA 1.
2. Il Reagente di conferma LA 2 è simile al Reagente di screening LA 1, ma contiene un’alta concentrazione di fosfolipidi. Questi fosfolipidi aggiuntivi agiscono conto gli anticorpi LA e cor -reggono ampiamente il tempo di coagulazione3.
3. Il test DRVV “aggira” il fattore VII del sistema estrinseco della coagulazione così come i fattori antiemolici e di contatto del sistema intrinseco. Pertanto, il Reagente di screening LA 1 è m olto più specico per gli LA del test aPTT, poiché non è inuenzato né da anomalie del fattore di contatto, né da decit del fattore VIII o anticorpi6. Sono stati sviluppati una serie di test sulla
base della correzione con fosfolipidi4, ma nessuno è risultato così appropriato come l’impiego
del Reagente di conferma LA 2 dopo il Reagente di screening LA 1.
4. E’ possibile utilizzare un test di miscelazione del plasma per escludere un decit di fattore II, V e X che provocherebbero un allungamento dei risultati del Reagente di screening LA 1 e del Reagente di conferma LA 2. Miscelando il plasma normale con il plasma in esame, si ripristinano i fattori mancanti nel plasma in esame. Se il risultato del test di miscelazione risulta ancora allungato, signica che un inibitore (come LA) è presente nel plasma in esame. Un tempo di coagulazione allungato, che non può essere corretto miscelando il plasma di paziente con plasma normale, indica la presenza di un inibitore circolante3,10.
Reagenti
ComposizioneIl Reagente di screening LA 1 e il Reagente di conferma LA 2 c ontengono veleno di vipera Russell, fosfolipidi, agenti anti-eparina, calcio, tamponi, stabilizzanti, sodio azide e colorante.
Avvertenze e precauzioni Solo per uso diagnosticoin-vitro .
Nell’eliminare il reagente attraverso lo scarico, far scorrere molta acqua per prevenire la formazione di residui esplosivi nelle tubature di metallo.
Preparazione del reagente
Ricostituire con la quantità d’acqua distillata indicata sull’etichetta. Mescolare bene mediante capo -volgimento per assicurare una completa risospensione del materiale liolizzato.
Conservazione e stabilità
I reagenti liolizzati, conservati a +2/+8 °C, sono stabili no alla data di scadenza indicata sull’eti -chetta.
I reagenti ricostituiti possono essere conservati per 8 ore a +37 °C, 24 ore a +20/+25 °C, 48 ore a +2/+8 °C e 1 mese a -20 °C.
Indice di instabilità / deterioramento
Se, aprendo il acone, non si osserva presenza di vuoto e/o il reagente non appare secco, deve essere restituito a Siemens Healthcare Diagnostics.
Raccolta e preparazione dei campioni
Il sangue deve essere prelevato e lavorato secondo lo standard NCCLS H21-A3: raccolta, trasporto e lavorazione dei campioni di sangue per test coagulativi e esecuzione generale dei metodi coa -gulativi, linee guida approvate - 3a edizione (1998). Il plasma separato deve essere conservato a
+2/+8 °C e analizzato entro 4 ore dal prelievo.
Se il campione va congelato, il plasma deve essere centrifugato una seconda volta per rimuovere le piastrine (inferiori a 10 x 109 /l)10, in quanto potrebbero accorciare il tempo di coagulazione del
Reagente di screening LA 1.
Esecuzione del test
1. Preriscaldare a +37 ± 1 °C poco più della quantità necessaria di Reagente di screening LA 1 e/o Reagente di conferma LA 2, calcolando 200 µl per test
2. Dispensare 200 µl del plasma in esame in una provetta di vetro e riscaldare per 1 minuto a +37 °C. 3. Aggiungere 200 µl del reagente di screening preriscaldato al plasma e cronometrare il tempo, dal momento dell’aggiunta del reagente no alla conclusione della reazione di coagulazione. 4. Ripetere il test per una determinazione in doppio e riportare il valore medio dei risultati del
test.
Metodo automatico
Sono disponibili, su richiesta, i protocolli per gli analizzatori Siemens.
I test con il Reagente di screening LA 1 ed il Reagente di conferma LA 2 devono essere eseguiti con la stessa quantità di plasma e reagente, come in molti protocolli per il tempo di trombina. Tuttavia, i tempi di lettura e interpretazione dei dati devono essere portati a 120 secondi.
Materiali forniti
LA 1[REAGENT],[REF]OQGP con
10 xl 2 mL LA 1[REAGENT], LA 1 Reagente di screening
LA 2[REAGENT],[REF] OQGR con
10 xl 1 mL LA 2[REAGENT], LA2 Reagente di Conferma
Materiale necessario ma non fornito Provette di vetro 10 mm x 75 mm Pipette da 200 µl, 1 ml, 2 ml o 5 ml Bagnomaria, cronometro Acqua depurata, USP o equivalente LA Controllo Alto ([REF] OQWD) LA Controllo Basso ([REF] OQWE) Controllo qualità
Ogni laboratorio dovrebbe stabilire i propri valori di accettabilità dei controlli ed un proprio intervallo normale.
LA Controllo Alto ([REF] OQWD) e LA Controllo Basso ([REF] OQWE) sono distribuiti da Siemens e
servono per il controllo qualità del Reagente di screening LA 1 e del Reagente di conferma LA 2. Il plasma di controllo e i campioni dei pazienti devono essere analizzati simultaneamente.
Risultati
Se il tempo di coagulazione con LA 1 rientra nell’intervallo normale, non è necessario eseguire altri test. Se il tempo di coagulazione con LA 1 è superiore a 2 DS o ca. il 20 % più lungo del valore medio del plasma normale (n ≥ 20), il risultato deve essere considerato anomalo e sottoposto a ulteriori indagini (vedere gura 1).
Il risultato nale può essere espresso meglio come rapporto (ratio) tra il tempo di coagulazione del Reagente di screening LA 1 e il tempo di coagulazione del Reagente di conferma LA 2.
Tempo di coagulazione Reagente di screening LA 1 Ratio LA = ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Tempo di coagulazione Reagente di conferma LA 2 Figura 1
1
Test di miscelazione
Se i risultati si trovano ai limiti, è possibile eseguire prove di miscelazione del plasma per corregge -re i difetti nascosti del campione e chiarir e la p-resenza degli LA. In questo test, da esegui-re come un normale test standard, il rapporto tra campione di plasma e plasma normale dovrebbe essere 50:50 (non utilizzare il Plasma di controllo della Siemens per le prove di miscelazione del plasma). Tabella 1: Combinazione di test di miscelazione e di conferma
LA1 LA2 Diagnosi
Plasma di
paziente Miscelapaziente + Normale
Plasma di
paziente Miscelapaziente + Normale
N N N N LAnonidenticati
ABN ABN N N LAidenticati
ABN N ABN N Decit fattore/TAO
ABN ABN ABN N LA + Decit fattore
ABN ABN ABN ABN Altro inibitore
Il calcolo di una ratio normalizzata può essere utile per correggere le differenze delle varie combinazio -ni reagenti/strumenti. Nella normalità, si usano i tempi di coagulazione medi del plasma normale ana -lizzato con il Reagente di screening LA 1 e Reagente di conferma LA 2 nel laboratorio dell’uti-lizzatore. Ciò può facilitare la differenziazione tra i campioni LA normali e quelli leggermente positivi.
Reagente di screening LA 1 del paziente Ratio normalizzata = ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Tempo normale medio Reagente di screening LA 1 X
Tempo normale medio Reagente di conferma LA 2
––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Reagente di conferma LA 2 del paziente
Il diagramma della gura 1 può essere utilizzato anche per interpretare le ratio normalizzate.
Limitazioni della esecuzione del test
Campioni che contengono coaguli e quelli con valori di ematocrito anormali devono essere elimi -nati. I campioni itterici, lipemici e emolitici dovrebbero essere analizzati con tecniche manuali, in quanto alcuni strumenti fotometrici danno falsi risultati.
Si raccomanda di non utilizzare i plasmi di controllo commercializzati senza indicazione della con -centrazione di citrato e piastrine.
Per gli studi comparativi, i test con il Reagente di screening LA 1 e il Reagente di conferma LA 2 dovrebbero essere eseguiti in simultanea.
Eseguire almeno 2 test di screening basati su principi analitici differenti. Eseguire, inoltre, una prova di miscelazione del plasma per vericare la presenza di inibitore della coagulazione, e un test di conferma per documentare la dipendenza dei fosfolipidi10.
Concentrazioni di eparina no a 1 unità/ml non hanno alcun effetto, per la presenza di un agente neutralizzante sia nel Reagente di screening LA 1 che nel Reagente di conferma LA 2. I risultati di questo test devono essere sempre interpretati alla luce della anamnesi del paziente, della presentazione clinica e valutando contestualmente l’esito di altri accertamenti.
Valori attesi
Con campioni di 26 individui sani di età compresa tra 18 e 55 anni e utilizz ando un metodo manua -le in provetta (tilt-tube), sono stati ottenuti intervalli normali di 31 - 44 secondi per il Reagente di screening LA1 e di 30 - 38 secondi per il Reagente di conferma LA 2. La ratio LA1/LA2 oscillava tra 0,8 e 1,2. Questi risultati devono intendersi solo come riferimento
Screening LA 1
Se la ratio ––––––––––––– è maggiore di 2,0: forte presenza di LA Conferma LA2
Screening LA 1
Se la ratio ––––––––––––– è compresa tra 1,5 e 2,0: moderata presenza di LA Conferma LA 2
Screening LA 1
Se la ratio ––––––––––––– è compresa tra 1,2 e 1,5: debole presenza di LA Conferma LA 2
Ogni laboratorio dovrebbe stabile il proprio intervallo normale, sia per il metodo manuale che per quello automatico, per poter bilanciare le differenze nel prelievo dei campioni e nella strumenta
-zione.
Caratteristiche speciche del test
Studi di precisione intra- ed inter-laboratori sono stati realizzati tanto con il metodo manuale in provetta (tilt-tube) quanto con il metodo automatico. Questi studi hanno dato un coefciente di variazione inferiore al 3,5 % su plasma normale e inferiore al 5 % per i campioni anormali. Studi di specicità sono stati effettuati su campioni di plasma noti.
Per i seguenti plasmi* e stata riscontrata una ratio positiva maggiore di 1,2, tra il Reagente di screening LA 1 e il Reagente di conferma LA 2:
Plasma LA 90 % (26/29)
Plasma eparinato 12 % (1/8) Plasma di paziente TAO 0 % (0/7) Plasma carente di fattore 0 % (0/5) Plasma normale 2 % (1/60)
* Per questi plasmi gli LA sono stati identicati con APTT + prove di miscelazione KCT.
Bibliograa
Vedi testo Inglese.
Edizione Ottobre 2008
Reactivo de screening LA 1/
Reactivo de conrmación LA 2
LA 1
[REAGENT]
/
LA 2
[REAGENT]
Reactivo para el tiempo de veneno de víbora de Russell diluido, ("Dilute Russell’s Viper Venom Time" reagent), simplicado, para la detección del anticoagulante lúpico.
Campos de aplicación
El reactivo de screening LA 1 y el reactivo de conrmación LA 2 son reactivos simplicados, del reactivo DRVVT para la detección del anticoagulante lúpico (LA), en un test de coagulación de una etapa.
Reactivo de screening LA 1
Reactivo DRVV simplicado para el screening del anticoagulante lúpico. Reactivo de conrmación LA 2
Reactivo DRVV rico en fosfolípidos para la corrección especíca del anticoagulante lúpico.
Signicado diagnóstico
Los anticoagulantes lúpicos (LA) son autoanticuerpos, los cuales están dirigido contra fosfolípidos cargados negativamente o contra los complejos de fosfolípidos, ya sea con beta-2-glicoproteína 1 o con factores de la coagulación como la protrombina. Ellos aparecen en diferentes estadios clí -nicos, especialmente en enfermedades autoinmunes1. Además, el LA es visto hoy como un factor
de riesgo signicante para pacientes con diferentes trombosis inexplicables y se puede reconocer frecuentemente en mujeres con abortos repetidos5. El LA se detecta normalmente por medio de
ensayos de coagulación sensibles a los fosfolípidos, tales como, APTT (tiempo de tromboplastina parcial activado), KCT (tiempo de coagulación con caolín) y el DRVVT2, en los cuales actúa como
inhibidor de la coagulación.
El test DRVVT comenzó a conocerse después de la publicación de Thiagarajan et al. en el año 19866. Este método ha sido estandarizado y simplicado7. Según Petri et al8. en trombosis de pa
-cientes con lupus eritematoso sistémico, es mucho mayor la posibilidad de detectar LA con DRVVT que el anticuerpo anticardiolipina con un ensayo inmunoenzimático (ELISA)5. Estas observaciones
fueron extendidas recientemente por Galli y Bevers9, quienes demostraron que el subtipo de LA
con más efecto sobre el test DRVVT es el dependiente de la beta-2-glicoproteína 1 y se diferencia del subtipo de LA dependiente de la protrombina, el cual tiene un fuerte efecto en la prolongación del test KCT.
Principio del método
1. El veneno de víbora de Russell contenido en el reactivo de screening LA 1 desencadena la coagulación del plasma mediante la activación directa del factor X. El anticuerpo LA prolonga el tiempo de coagulación del reactivo de screening LA 1.
2. El reactivo de conrmación LA 2 es similar al reactivo de screening LA 1, pero contiene una mayor concentración de fosfolípidos. Estos fosfolípidos adici onales actúan en contra de el an -ticuerpo LA y de esta manera corrigen casi completamente el tiempo de coagulación3.
