Production of Recombinant Bacmid Containing the Coding Sequence of Human Hepcidin

(1)

رٍ ىبْیک ادً

یکضضپ یسٍبٌف تسیص ذضسا یسبٌضسبک یَدطًاد ُذکطًاد، يف یبّ یسٍآ يیًَ ،یکضضپ ُبگطًاد مَلػ

یکضضپ ،ىبتسلگ ،ىبگشگ ىاشیا

یئازجت ىبجیلع

، سبیدبتسا ٍُشگ ،یکضضپ یسبٌض سٍشیٍ

ُبگطًاد ،یکضضپ ُذکطًاد ،یطَلَیثٍشکیه مَلػ

یکضضپ ،ىبتسلگ ،ىبگشگ ىاشیا

یًادشی ةَقعی

مَلػ تبقیقحت ضکشه ،یکضضپ یسبٌض یٌویا سبیدبتسا ، یًَفػ یبّ یسبویث تبقیقحت ضکشه ٍ یّبگطیبهصآ ُبگطًاد مَلػ یکضضپ ،ىبتسلگ ،ىبگشگ ىاشیا

یًادشی ةَقعی : لَئغه ُدٌغیًَ

:يفلت 09125757292

:کیًٍزتکلا تغپ

[email protected]

:طردآ یبّ یسٍبٌف ُذکطًاد

ىبتسلگ یکضضپ مَلػ ُبگطًاد،يیًَ

:ِلبقه تفبیرد 15

/ 11 / 91

:ییبًْ ؼیازیٍ 10

/ 12 / 91

ػزیذپ : 18 / 1 / 92 ُدیکچ

ِهدقه ىآ صبس صیپ لکض ِک تسا يیئتسیس صا یٌغ یثٍشکیه ذض ذیتپپ کی يیذیسپّ:

.دَض یه حضشت ذجک صا لوػ بّ ذسبق ٍ بّ سٍشیٍ ،بّ یشتکبث صا یؼیسٍ ٌِهاد ِیلػ ذیتپپ يیا

ُذض ِتخبٌض ىذث يّآ صبتسَئهَّ شگ نیظٌت يیشت یلصا ىاٌَػ ِث يیٌچوّ يیذیسپّ .ذٌک یه دشتسگ یبّ شلات ُصٍشها .تسا صا یکی .تسا ِتفشگ تسَص يیذیسپّذیلَت یاشث یا ُ

سٍشیٍَلکبث یًبیث نتسیس ، يیذیسپّ ذیلَت یاشث ُدبفتسا دسَه یتَیسبکَی یًبیث یبّ نتسیس سد يیذیسپّ ذیلَت شیسه سد لحاشه يیشت یلصا صا یکی تیکشتًَ یًط ُصبس ذیلَت .ذضبث یه .تسا یًبیث نتسیس يیا یعرزث ػٍر اذتثا :

RNA ُدس یبّ لَلس صا مبت HepG2

ُذٌٌک ذیلَت لَلس ىاٌَػ ِث

ضتٌس صا سپ ٍ ُذض جاشختسا يیذیسپّ cDNA

ِؼغق ،لک يیذیسپّ ِث طَثشه

ظسَت یًبسًا

شٍس ِث يیذیسپّ یصبصتخا یبّ شویاشپ PCR

ِؼغق يیا ذؼث ِلحشه سد .ذض شیثکت ىٍسد

لقبً pTZ57R/T ىَلک

یبّ نیضًآ ظسَت یویضًآ ششث شٍس ِث ِعَثشه ِؼغق ىبیبپ سد .ذض

BamHI ٍ ECoRI لقبً سد ىط دٍسٍ لحه ىٍسد ِث pFast BacHTB

.ذض لقتٌه

:بّ ِتفبی يیذیسپّ ُذٌٌک ذک ِؼغق

ىٍسد حیحص سَع ِث یًبسًا لقبً

pTZ57R/T

ىٍسد گٌیًَلک ةبس لحاشه ٍ ُذض ىَلک لقبً

pFast Bac HT B .ذض مبدًا تیقفَه بث

ذًبث سَضح 274

شیثکت صا لصبح یصبث تفخ PCR

تحص ُذٌّد ىبطً یویضًآ ششث ٍ

.دَث سبک مبدًا لحاشه یزیگ ِجیتً ُصبس ذیلَت صا دسَه يیتسخً ِؼلبغه يیا ُذض مبدًا یبَّدتسخ سبسا شث :

یًبسًا لهبک يیذیسپّ ُذٌٌک ذک ِؼغق ذخاٍ تیکشتًَ یًط .تسا سَطک سد

یًط یبّ ُصبس

سد یًبسًا يیذیسپّ لهبک مشف ذیلَت سَظٌه ِث ذًاَت یه ِؼلبغه يیا صا لصبح تیکشتًَ .دشیگ ساشق ُدبفتسا دسَه ُذٌیآ تبؼلبغه یدیلک یبّ ُصاٍ :

يیذیسپّ ،یًط ُصبس يّآ ،

یاراد

ِجتر

یولع

–

یؾٍّضپ

سا ىَیغیوک مَلع تبیزؾً

یکؽشپ

رَؾک

لَت ی د یًص ُسبع تیکزتًَ

ٍبح ی ِعطق دک ُدٌٌک غپّ ی د ی ي ًبغًا ی

طردآ :ِلبقه

سٍ ىبْیک ،ى ی یًادضی ،ع یئاشجت "

لَت ی ذ یًط ُصبس تیکشتًَ ٍبح ی ِؼغق ذک ُذٌٌک سپّ ی ذ ی ي ًبسًا ی ،یّبگطیبهصآ مَلػ ِلده ىبتسثبت

1392 ،

ُسبوض(نتفّ ُسٍد 2

:) 6 -1

(2)

ِهدقه يیذیسپّ بث يیئتسیس صا یٌغ یثٍشکیه ذض ذیتپپ کی

تسا یذیفلَس ید یبّ ذًَیپ (

1 ) یلجق یبّ شساضگ .

،فلتخه ی بّ ًَِگ ىبیه سد ذیتپپ يیا ِک تسا يیا یبیَگ

یقبث ُذض تظبفح ،ىبسًا لثه ىاساذًبتسپ بت ِتفشگ یّبه صا

تسا ُذًبه (

2 ). يیذیسپّ ا تلغ لَلس سد تفبی یذجک یبّ

ُذض دَض یه ىبیث سَویت ٍ تلق،ُدٍس ،ُذؼه سد شتوک ٍ

( 3 ). ذًَیپ یٍبح ذیتپپ يیا ِک تسا يیا صا یکبح یبّ ِلبغه

کی ذیتپپ يیا ِدیتً سد ٍ تسا لَوؼه شیغ یذیفلَس ید

یثٍشکیه ذض یبّ ذیتپپ صا یذیذخ سلاک دَض یه یقلت

( 4 ) . ذیتپپ يیا بیضشضا ذًٌبه ، بّ یشتکبث صا یؼیسٍ ٌِهاد ِیلػ

سَکَکَلیفبتسا ،سَئسٍا سَکَکَلیفبتسا ،یلَک

بّ سٍشیٍ ِیلػ ضیً ٍ سَکَکَتپشتسا ة ٍُشگ ٍ سیهسذیپا

سَلیطشپسآ ،سًبکیجلآ اذیذًبک شیظً ییبّ ذسبق ٍ

ذٌک یه لوػ شدیً سَلیطشپسآ ٍ سَتبگیهَف (

2 ). ِلبغه

يّآ ةزخ غًبه يیذیسپّ ِک تسا ُداد ىبطً فلتخه یبّ

ُشیخر يّآ ىذض داصآ سبْه ثػبث ٍ ُذض کچَک ُدٍس صا

دَض یه لبیلتٍذًاٍَکیتس یبّ لَلس شیبس ٍ طبفٍشکبه صا یا

( 5 ) . تسا یلَلس يّآ ُذٌّد لبقتًا لبًبک کی يیتسَپٍشف

ذٌک یه صقً یبفیا يیذیسپّ سَتپسس ىاٌَػ ِث ِک (

7 ، 6 ) .

یلصا ىاٌَػ ِث يیذیسپّ صا ىاَت یه يیا شثبٌث نیظٌت يیشت

.دشک دبی ىذث سد يّآ ُذٌٌک ذیلَت تْخ یفلتخه یبّ شٍس

،لبثه ىاٌَػ ِث .دساد دَخٍ يیذیسپّ صا ىاَت یه اس يیذیسپّ

ُذض صیلخت يیذیسپّ ىاضیه یلٍ .دشک اذخ ساسدا بی بوسلاپ

تسا نک سبیسث ُاس يیا صا لصبح (

2،4 ). اس مٍد ُ ضتٌس

یدشکلوػ کیتتٌس يیذیسپّ ذیلَت لحاشه .تسا يیذیسپّ

یه ُسبثٍد گٌیذلَف ذٌیاشف ذٌهصبیً ٍ ُدَث ساَضد سبیسث ذضبث

( 8 ) يیٌچوّ . نتسیس سد ذًاَت یه يیذیسپّ

یبّ یًبیث صا

ِلوخ نتسیس يیا تیضه .دَض ذیلَت ضیً ییبیشتکبث یبّ

یًبیث

ٍ تسا دبیص لَصحه ٍ نک ٌِیضّ یل

یا ِوخشت سپ تاشییغت

ىاساذًبتسپ یبّ لَلس سد ىبیث بث ِسیبقه سد ذضبث یوً ذهآسبک

( 9 ) بیث یبّ نتسیس صا یشگید عًَ ضیً یچسبق یًبیث نتسیس. یً

مذػ ،نک ٌِیضّ ،لابث ىبیث( فلتخه یبیاضه نغس یلػ ِک تسا

لیلد ِث ،)بّ يیئتٍشپ ذهآسبک گٌیذلَف ٍ يیسکَتٍذًا دَخٍ یبّ ذحاٍ ىدٍضفا

غیشس فزح ِث شدٌه ِک صًَبه یذٌق

ىبیث یاشث ،دَض یه ىَخ شدشگ صا ُذض ذیلَت يیئتٍشپ

.ذضبث یوً یجسبٌه سبیسث ٌِیضگ یتَیسبکَی يیئتٍشپ ه

ِلبغ

یبّ یبّ ًَِگ يیذیسپّ گٌیًَلک ٌِیهص سد یًَگبًَگ

عاًَا سد فلتخه یًبیث نتسیس ِلوخصا یًبیث یبّ نتسیس

تسا ِتفشگ تسَص ... ٍ یچسبق یًبیث نتسیس ،ییبیشتکبث

( 15،10 .) یًبیث نتسیس ذیلَت سد شگید یضٍس سٍشیٍَلَکبث

.ذضبث یه یتَیسبکَی تیکشتًَ یبّ يیئتٍشپ سپ تاشییغت

سبیسث دٍذح بت یًبیث نتسیس يیا سد یا ِوخشت بث ِثبطه یدبیص

تسا ىاساذًبتسپ یبّ لَلس (

16 ) . نتسیس يیا شگید تیضه

لیجق صا ییبیشتکبث یاضخا بث یگدَلآ دَجً ذیسبکبس یلپَپیل

اس یٌویا خسبپ يیئتٍشپ يیا یشیگسبک ِث ِدیتً سد ، ذضبث یه

دشک ذّاَخً ِتخیگًاشث (

17 ).

یعرزث ػٍر

گنینولک cDNA نورد نیدیسپه لقبً

pTZ57R/T يیا سد

یبّ لَلس ،ِلحشه

HepG2

ذیلَت یلَلس غجٌه کی ىاٌَػ ِث

جاشختسا صا سپ .ذًذض ُداد تطک،يیذیسپّ ُذٌٌک

RNA ،

ضتٌس

cDNA

ذیتپپٍشپ یشپ ِث طَثشه ِؼغق شیثکت ٍ لبتَت

تیک ظسَت یًبسًا يیذیسپّ

OneStep RT-PCR

،ىطبیک(

)ىبولآ ذض مبدًا دسَه یبّ شویاشپ یذیتَئلکًَ یلاَت .

ششث یبّ یلاَت .تسا ُذض ُدسٍآ لیر سد ُدبفتسا

یویضًآ

BamHI

ٍ

ECoRI

ىٍسد گٌیًَلک ةبس تْخ

لقبً .ذض دساٍ یصبصتخا یبّ شویاشپ یبْتًا ٍد سد ،یًبیث

صسبگآ یٍس یصبساذخ ٍ ُذّبطه تْخ ُذض شیثکت ِؼغق

5 / 1 ذصسد تیک ظسَت ٍ ذض صسَفٍشتکلا

" QIAquick Gel

Extraction "

جاشختسا ِؼغق .ذض جاشختسا )ىبولآ، ىطبیک(

تیک ظسَت ُذض

TA Cloning

)ىبولآ ،صبتٌهشف( ىٍسد

لقبً

pTZ57R/T

.ذض ىَلک لقبً

ىٍسد ُذض ذیلَت تیکشتًَ

ذؼتسه یشتکبث

XL1Blue

ظیحه یٍس ٍ ُذض ذض لقتٌه

( يیلیس یپهآ کیتَیث یتًآ یٍبح سبگآ 100

سد مشگٍشکیه

ٍ )شتیل یلیه ( لبگ یاشتسثَس

100 ٍ )شتیل یلیه سد مشگٍشکیه

لا ــ ق ــ ک ب ـٌ ـٌ ــ ُذ

IPTG

( 40 یه ـ )شتیل یلیه سد مشگٍشک

ض ُداد تطک ــ

ک شٍس صا ِلحشه يیا سد .ذ ـل

ـ یس ـ ک ن ـل ـ ذیاش

ُربوؽ(نتفّ ُرٍد،یّبگؾیبهسآ مَلع ِلجه 2

) ىبتغثبت 92

(3)

يیا ٍ ذض ُدبفتسا تیحلاصبث یبّ یشتکبث ِیْت تْخ

.ذًذض مسَفسًاشت یتساشح کَض شٍس ظسَت بّ یشتکبث

تذه ِث تیکشتًَ یشتکبث یٍبح یبّ تیلپ 1

سد تض

یبهد 37 داشگ یتًبس ِخسد یسازگ ًِبخهشگ

سپس .ذًذض

یاساد یبّ یٌلک لقبً

تْخ ٍ ُذض ةبختًا حیحص

ضح تحص یسسشث ٍ ذیهصلاپ جاشختسا شظً دسَه ِؼغق سَ

( يیلیس یپهآ کیتَیث یتًآ یٍبح غیبه ظیحه سد 100

یبهد ٍ )شتیل یلیه سد مشگٍشکیه 37

ِث داشگ یتًبس ِخسد

سپ .ذًذض ُداد تطک تض کی تذه ذیهصلاپ ىآ صا

ییبیلق شٍس ِث، ُذض ُداد تطک تیکشتًَ یبّ شتکبث

شٍس ٍد ِث ٍ ذض جاشختسا

PCR

یبّ شویاشپ بث

یسپّ یصبصتخا نیضًآ ظسَت یویضًآ ششث شٍس ٍ يیذ

یبّ

Fast digest BamHI

صبتٌهشف( ىبولآ ، ٍ )

Fast

digest ECoRI

صبتٌهشف( ىبولآ ، .ذًذض یسسشث ) سبک َُحً

ِک دَث تسَص يیا ِث 1

ذیهصلاپ مشگٍشکیه

pTZ57-Hepc

، 1 نیضًآ شتیلٍشکیه

BamHI

، 1 نیضًآ شتیلٍشکیه

صبتبفسف يیلبکلآ

Fast AP

،)صبتٌهشف( 2

شفبث شتیلٍشکیه

x

10

صا یسبػ ُضیًَید ةآ ظسَت ٍ ِتخیس صٌکاٍ ِلَل ىٍسد اس

RNase

ٍ

DNase

ییبًْ ندح ِث 20

ُذًبسس شتیلٍشکیه

تذه ِث ًَِوً سپس .ذض 15

یبهد سد ِقیقد 37

ِخسد

داشگ یتًبس یسازگ ًِبخهشگ

لبؼف شیغ تْخ ِلَل .ذض

صبتبفسف يیللابکلآ نیضًآ یصبس 20

یبهد سد ِقیقد 75

داشگ یتًبس ِخسد یسازگ ًِبخهشگ

سپس .ذض 1

نیضًآ شتیلٍشکیه

Fast digest ECoRI

صبتٌهشف( ىبولآ ، ) ،

یبهد سد ُسبثٍد ٍ ذض ِفبضا صٌکاٍ ِلَل ِث 37

ِخسد

داشگ یتًبس یسازگ ًِبخهشگ

اسَتسد بث قثبغه( ذض لوؼل

ٍ یویضًآ ششث لَصحه .)ُذًصبس تکشض ییبًْ لَصحه

PCR

لط یٍس 5 / 1 ذصسد .ذض صسَفٍشتکلا يیا شث ٍُلاػ

،یلاَت تحص صا ییبًْ ىبٌیوعا تْخ لقبً

تیکشتًَ

pTZ57-Hepc

صا سپ .ذض لبسسا یثبی یلاَت یاشث

تْخ شظً دسَه ِؼغق ،گٌیًَلک مبدًا تحص صا ىبٌیوعا

ىٍسد گٌیًَلک ةبس لقبً

pFastBac HT B

دسَه

.تفشگ ساشق ُدبفتسا ىٍرد يیدیغپّ ىص گٌیًَلک ةبع

لقبً

pFastBac1

: لقبً تیکشتًَ

pTZ57-Hepc

یبّ نیضًآ ظسَت

Fast

digest BamHI

ٍ

Fast digest ECoRI

ٍ ُدسَخ ششث

صسبگآ لط یٍس یویضًآ ششث لَصحه 5

/ 1 صسَفٍشتکلا %

ذًبث .ذض 274 یًبسًا يیذیسپّ یلاَت ِث طَثشه یصبث تفخ

لط جاشختسا تیک ظسَت

" QIAquick Gel Extraction "

،ىبهضوّ .ذض صیلخت )ىبولآ ،ىطبیک( لقبً

pFastBac

HT B

شٍس ظسَت ضیً

Double Digestion

.ذض یغخ

تٍبفت يیا بث ،ذض مبدًا لجق شٍس قثبغه سبک يیا لحاشه

نیضًآ ٍد شّ لٍا ِلحشه ىبوّ سد ِک

BamHI

ٍ

ECoRI

ىبٌیوعا یاشث .ذض ِفبضا صٌکاٍ ِلَل ِث ىبهضوّ یغخ صا

لط یٍس ىذض 0.8

یغخ ذیهصلاپ .ذض مبدًا صسَفٍشتکلا %

لط جاشختسا تیک ظسَت

" QIAquick Gel Extraction "

صا لصبح ِؼغق ىَیسبگیل .ذض جاشختسا )ىبولآ ،ىطبیک(

ششث ِث طَثشه ُذٌجسچ یبْتًا یٍبح ِک لط جاشختسا

صا لصبح ُذٌجسچ یبْتًا ٍد ِث تسا لابث نیضًآ ٍد ظسَت

ششث لقبً

pFast Bac HT B

یغخ يیا سد .ذض مبدًا

تجسً ِلحشه 1:3

صا لقبً یغخ

pFastBac HT B

ِؼغق ٍ

سد ىَیسبگیل .ذض ُدبفتسا يیذیسپّ 16

داشگ یتًبس ِخسد

ٍ ذض مبدًا تض کی تذه ِث لقبً

تیکشتًَ

pFastBac

HT B-Hepc

ِث یتساشح کَض شٍس بث يیذیسپّ یٍبح

تیحلاص بث یشتکبث ىٍسد

XL1Blue

. تفبی لبقتًا

سد ذضس ییبًاَت تیکشتًَ ذیهصلاپ یٍبح یبّ یشتکبث

یه یٌلک لیکطت ٍ ِتضاد اس يیلیس یپهآ یٍبح ظیحه

ِث لجق ِلحشه تیکشتًَ یبّ یٌلک ذیهصلاپ سپس .ذٌّد

ةبس مبدًا تحص ٍ ُذض جاشختسا ییبیلق ضیل شٍس

شٍس صا ُدبفتسا بث گٌیًَلک

PCR

لَصحه ٍ ذض یسسشث

PCR

لط یٍس 5

/ 1 ذصسد يیٌچوّ .ذیدشگ صسَفٍشتکلا

یویضًآ ششث لقبً

تیکشتًَ

pFast Bac HT B-Hepc

يیا ِک تیتشت يیا ِث .تفشگ ساشق یسسشث دسَه لقبً

نیضًآ ٍد ىبوّ ظسَت تیکشتًَ

Fast digest EcoRI

ٍ

Fastdigest BamHI

لط یٍس ِدیتً ٍ ذض ُداد ششث

صسبگآ 5 / 1 ذصسد .ذیدشگ ُذّبطه

زویازپ یدیتَئلکًَ یلاَت

ForwardHepcidin

5` GGATCCGACGGCACGATGGCACTGAGC 3

ReverseHepcidin

5` GAATTCGGTTCTACGTCTTGCAGCACATCC 3`

ِلجه ُربوؽ(نتفّ ُرٍد،یّبگؾیبهسآ مَلع 2

ىبتغثبت ) 92

(4)

بّ ِتفبی يتفشگ شظً سد بث ِک يیذیسپّ ٍشپ یشپ ُذٌٌک دذک یًط ِؼغق

دٍذح سد یویضًآ ششث یبّ تیبس 274

دَث یصبث تفخ

شٍشث یصبصتخا یبّ شویاشپ ظسَت

PCR

(تفبی شیثکت

.)تسا ُذطً ُداد ىبطً حیبتً ذیلَت ٍ گٌیًَلک صا سپ

لقبً

تیکشتًَ

pTZ57-Hepc

ساد تیحلاص یبّ یشتکبث ،

XL1blue

يیا ظسَت ُذض مسَفسًاشت لقبً

یٍس تیکشتًَ

یبّ یٌلک .ذض ُداد تطک يیلیس یپهآ یٍبح سبگآ ظیحه

ِث مٍبقه ٍ ُذض مسَفسًاشت یبّ یشتکبث صا لصبح ذیفس

ىط کی ىاٌَػ ِث اس تیکشتًَ لقبً لابوتحا يیلیس یپهآ

فشیزپ یخسبخ .)تسا ُذطً ُداد ىبطً حیبتً (ذًا ِت

ذیهصلاپ

ىط سَضح ذیئبت تْخ یثبختًا یبّ یٌلک صا ُذض جاشختسا

شٍشث يیذیسپّ ىط یصبصتخا یبّ شویاشپ بث يیذیسپّ

PCR

ه ـ ث دسَ ـ سسش ـ ق ی ـ فشگ ساش ـت ـٌ .ذـ ذًبث سَضح 274

یصبث تفخ تحص ضیً ٍ يیذیسپّ ٍشپ یشپ ِؼغق سَضح شگًبیث

ىٍسد گٌیًَلک لقبً

pTZ57R/T

ُداد ىبطً حیبتً ( تسا

سًبکس جاشختسا ٍ یویضًآ ششث صا سپ .)تسا ُذطً

يیذیسپّ ٍشپ یشپ ِؼغق گٌیًَلک ةبس ،لط صا يیذیسپّ

ىٍسد لقبً ُذض یغخ

pFastBac HT B

.تفشگ تسَص

تیحلاصبث یبّ یشتکبث سپس

XL1blue

بث ُذض لقتٌه لقبً

تیکشتًَ

pFastBac HT B-Hep ،

یٍبح سبگآ تیلپ یٍس

یبّ یٌلک صا لصبح ذیهصلاپ .ذض ُداد تطک يیلیس یپهآ

ِتفبی ذضس بث ُذض جاشختسا يیذیسپّ سًبکس جسد تحص

یبّ شٍس

PCR

یصبصتخا یبّ شویاشپ صا ُدبفتسا بث

یبّ نیضًآ بث یویضًآ ششث یَگلا ٍ يیذیسپّ

Fastdigest

ECoRI

ٍ

Fast digest BamHI

یبّ ذًبث .ذض یسسشث 274

ىَلک يیذیسپّ ِؼغق سَضح تحص ُذٌّد ىبطً یصبث تفخ

لکؽ 1 ػٍر ِث يیدیغپّ یصبصتخا یبّ زویازپ طعَت يیدیغپّ ظًبکع جرد تحص یعرزث

PCR

دًبث . 274 ُدٌٌک دک ِعطق رَضح ُدٌّد ىبؾً یسبث تفج

ًَِوً لبتا یبّ ىَتع(.تعا یًبغًا يیدیغپّ M=

)یلَکله ىسٍ صخبؽ

ُربوؽ لکؽ 2

یبّ نیشًآ طعَت يیدیغپّ ظًبکع جرد تحص یعرزث

ECoRI

ٍ

BamHI

دًبث .یویشًآ ػزث ػٍر ِث 274

ىَتع(يیدیغپّ ُدٌّد ىبؾً یسبث تفج

ًَِوً لبتا یبّ M=

.تعا )یلَکله ىسٍ صخبؽ

(5)

ىٍسد ُذض لقبً

تیکشتًَ

pFastBac HT B-Hep

لکض(تسا 1

ذیئبت ضیً یویضًآ ششث شٍس بث ُداد يیا .)

لکض(ذض 2 ىَتس .)

M

شکسبه ُذٌّد ىبطً ضیً لکض يیا سد

.ذضبث یه یلَکله

ثحث لبس سد 2000 یبقآ Krause

سبث يیلٍا یاشث صًاسبکوّ ٍ

ذیتپپ اشًآ ٍ ذًدشک صیلخت ىبسًا یبوسلاپصا اس يیذیسپّ

ذًذیهبً ذجک صا ُذض ىبیث یثٍشکیه ذض (

4 ) یًبیث یبّ نتسیس .

ذًساد دَخٍ تیکشتًَ یبّ يیئتٍشپ ذیلَت تْخ یفلتخه

ضیً یجیبؼه یاساد ،دَخَه یبیاضه سبٌک سد ماذکشّ یلٍ

ِث ِتسث ِک ذٌتسّ صا ىاَت یه فذّ يیئتٍشپ عًَ ٍ سبظتًا

شث ِتفشگ تسَص یلجق تبؼلبغه یع سد .دشک ُدبفتسا بًْآ

یًبیث نتسیس سد ُذض ذیلَت یضَه يیذیسپّ یٍس

ٍ گٌیذلَف صا ذیتپپ يیا ِک ذض صخطه سٍشیٍَلَکبث

داد یه ىبطً تبؼلبغه .تسا سادسَخشث یلَجق لثبق دشکلوػ

بک ِث سدبق بٌْت ًِ يیذیسپّ ِک سد يیتسَپٍشف ىبیث حغس صّ

یتسیص ظیاشض ٍ یّبگطیبهصآ ظیاشض

( In vivo )

،ذضبث یه

( تسا ضیً يّآ یهشس حغس صّبک ِث سدبق ِکلث 19

يیا شث .)

ٍساد کی ىاٌَػ ِث يیذیسپّ صا یشیگ ُشْث سَظٌه ِث سبسا

بدًآ صا .نییبوً ذیلَت ضیً اس ىآ یًبسًا مشف ِک نیذض ىآ شث

يیتسخً ذهآسبک ٍ تسبٌه یًط یبّ ُصبس تخبس ٍ ذیلَت ِک

یًبسًا تیکشتًَ يیذیسپّ ذیلَت سد مبگ یبّ ُصبس ،ذضبث یه

ٌِیهص سد یفلتخه تبؼلبغه .ذیدشگ ذیلَت شظً دسَه یًط

یبّ نتسیس عاًَا سد فلتخه یبّ ًَِگ يیذیسپّ گٌیًَلک

لبس سد لبثه ىاٌَػ ِث .تسا ِتفشگ تسَص یًبیث 2005

يیذیسپّ -25 ییبیشتکبث یًبیث نتسیس سد یًبسًا (

E.Coli )

َث یثٍشکیه ذض تیصبخ یاساد ٍ ُذض ذیلَت د

( 12 ) يیٌچوّ .

سپّ لبس ىبوّ سد يیذی

-20 ییبیشتکبث یًبیث نتسیس سد یًبسًا

( E.Coli ) دشکلوػ ذقبف ُذض ذیلَت ذیتپپ بها .ذض ذیلَت

دَث ( 10 ) لبس سد يیا شث ٍُلاػ . 2008

سد یًبسًا يیذیسپّ ،

يیذیسپّ مشف ٍد

-20 يیذیسپّ ٍ

-25 یچسبق یًبیث نتسیس سد

( Pichia Pastoris )

ىدَث اساد شگًبطً حیبتً ٍ ذض ذیلَت نیظٌت ییبًاَت يیٌچوّ ٍ کیتبتساَیشتکبث تیصبخ

ئهَّ دَث ُذض ذیلَت یبّ ذیتپپ یلَلس يّآ صبتسَ (

13 ) ٍُلاػ .

یٍس شث یشگید فلتخه تبؼلبغه ، يیذیسپّ یًبسًا مشف شث

فلتخه یًبیث یبّ نتسیس سد بّ ًَِگ شیبس يیذیسپّ ذیلَت

تسا ِتفشگ تسَص ( 14 -11 ، 15 ). بث دبٌتسا ِث تلابقه دَخَه سد دسَه ًَلک ی گٌ سپّ ی ذ ی ،ي ا ی ِؼلبغه ي لٍا ی ي ِؼلبغه سد ه ـ دسَ ک ـل ـ ًَ یٌ ـ گ ّ ـ سپ ـی ذ ـی ي ًا ـ ًبس ی س سد یـ نتس ث ـیـ ًب یـ ذضبث . به صا ا ی ي س ی نتس اشث ی ىَلک صبس ی صخث شپ ی ٍشپ تپپ ی ذ سپّ ی ذ ی ي ًبسًا ی ٍ تخبس یًط یبّ ُصبس کشتًَ ی ت ٍبح ی ِؼغق ذک ُذٌٌک سپّ ی ذ ی ي ًبسًا ی ُدبفتسا دشک ی ن . شث فلاخ س ی نتس بّ ی ث ی ًب ی شتکبث یب یی ، س ی نتس ث ی ًب ی سٍشیٍَلکبث تپپ ی ذ بّ ٍ ئتٍشپ ی ي بّ یی اس ث ی ىب ه ی ذٌک ِک صا شظً غت یی تاش سپ ِوخشت ا ی جض ی ِ ئتٍشپ ی ي بّ ی بْلَلس ی ىاساذًبتسپ ذٌتسّ ٍ صا بدًآ یی ِک غت یی تاش سپ ِوخشت ا ی لهبػ وْه ی اشث ی لبؼف ی ت ث ی طَلَ ی ک ی ٍ تبؼلبغه دشکلوػ ئتٍشپ ی ي ،ذٌتسّ ها ی ذ تسا بت ىاَتث سد تبؼلبغه تآ ی ئتٍشپ ی ي کشتًَ ی ت سپّ ی ذ ی ي اس سد ا ی ي س ی نتس ث ی ًب ی لَت ی ذ دشک . یزیگ ِجیتً سد لحاشه يیشت یلصا صا یکی تیکشتًَ یًط ُصبس ذیلَت

شیسه یًبیث نتسیس سد يیذیسپّ ذیلَت .تسا سٍشیٍَلکبث

شث

صا دسَه يیتسخً ِؼلبغه يیا ُذض مبدًا یبَّدتسخ سبسا

يیذیسپّ ُذٌٌک ذک ِؼغق ذخاٍ تیکشتًَ یًط ُصبس ذیلَت

یًبسًا لهبک تیکشتًَ یًط یبّ ُصبس .تسا سَطک سد

لهبک مشف ذیلَت سَظٌه ِث ذًاَت یه ِؼلبغه يیا صا لصبح

يیذیسپّ .دشیگ ساشق ُدبفتسا دسَه ُذٌیآ تبؼلبغه سد یًبسًا

زکؾت ٍ زیدقت ظسَت ِتفشگ تسَص یلبه تیبوح لحه صا ِلبقه يیا

.تسا ِتفشیزپ تسَص ىبتسلگ یکضضپ مَلػ ُبگطًاد

نًبخ سبکشس ضیضػ ىاسبکوّ تبوحص صا يیٌچوّ

سد ِک یٍشسخ ةَیا ٍ شیه یفغصه ىبیبقآ ٍ یدبطیلکسبطیه

سبک مبدًا یه یًادسذق ٍ شکطت ذًدَوً یًبیبض کوک ،

.نییبوً

(6)

11. Srinivasulu B, Syvitski R, Seo JK, Mattatall NR, Knickle LC, Douglas SE. Expression, purification and structural characterization of recombinant hepcidin, an antimicrobial peptide identified in Japanese flounder,

Paralichthys olivaceus. Protein Expr Purif. 2008; 61(1):

36-44.

12. Zhang H, Yuan Q, Zhu Y, Ma R. Expression and

preparation of recombinant hepcidin in Escherichia coli.

Protein Expr Purif. 2005; 41(2): 409-16.

13. Koliaraki V, Marinou M, Samiotaki M, Panayotou G, Pantopoulos K, Mamalaki A. Iron regulatory and bactericidal properties of human recombinant hepcidin

expressed in Pichia pastoris. Biochimie. 2008; 90(5):

726-35.

15. Greenshields AL, Knickle LC, Syvitski R, Douglas

SE. Strategies for recombinant expression of small,

highly disulphide-bonded, cationic antimicrobial

peptides. Protein Pept Lett. 2008; 15(9): 985-94.

14.Lee SJ, Park IS, Han YH, Kim YO, Reeves PR.

Soluble expression of recombinant olive flounder

hepcidin I using a novel secretion enhancer .Mol Cells.

2008; 26(2): 140-5.

16. Patterson RM, Selkirk JK, Merrick BA. Baculovirus and insect cell gene expression: review of baculovirus

biotechnology. Environ Health Perspect. 1995; 103(7-8):

756-9.

17. Hervas-Stubbs S, Rueda P, Lopez L, Leclerc C.

Insect baculoviruses strongly potentiate adaptive immune

responses by inducing type I IFN. J Immunol. 2007;

178(4): 2361-9.

18 . Malyszko J. Hemojuvelin: the hepcidin story

continues. Kidney Blood Press Res. 2009; 32(2): 71-6.

19. Yazdani Y, Sadeghi H, Alimohammadian M, Andalib A, Moazen F, Rezaei A. Expression of an Innate Immune Element (Mouse Hepcidin-1) in Baculovirus Expression System and the Comparison of Its Function with

Synthetic Human Hepcidin-25. Iran J Pharm Res. 2011;

10(3): 559-568. References

1 . Hunter HN, Fulton DB, Ganz T, Vogel HJ. The solution structure of human hepcidin, a peptide hormone with antimicrobial activity that is involved in iron uptake

and hereditary hemochromatosis. J Biol Chem. 2002;

277(40): 37597-603.

2. Park CH, Valore EV, Waring AJ, Ganz T. Hepcidin, a

urinary antimicrobial peptide synthesized in the liver. J

Biol Chem. 2001; 276(11): 7806-10.

3. Pigeon C, Iiyin G, Courselaud B, Leroyer P, Turlin B, Brissot P, et al. A new mouse liver-specific gene, encoding a protein homologous to human antimicrobial

peptide hepcidin, is overexpressed during iron overload.

J Biol Chem. 2001; 276(11): 7811-9.

4. Krause A, Neitz S, Magert HJ, Schulz A, Forssmann WG, Schulz-Knappe P, et al. LEAP-1, a novel highly disulfide-bonded human peptide, exhibits antimicrobial

activity. FEBS Lett. 2000; 480(2-3): 147-50.

5. Nicolas G, Bennoun M, Porteu A, Mativet S, Beaumont C, Grandchamp B, et al. Severe iron deficiency anemia in transgenic mice expressing liver

hepcidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99(7):

4596-601.

6 . Carstens BB. The analysis of the interaction between

hepcidin and ferroportin. Masters thesis: Queensland.

2009.

7. De Domenico I, Nemeth E, Nelson JM, Phillips JD, Ajioka RS, Kay MS, et al. The hepcidin-binding site on

ferroportin is evolutionarily conserved. Cell Metab.

2008; 8(2): 146-56.

8. Rivera S, Nemeth E, Gabayan V, Lopez MA, Farshidi D, Ganz T. Synthetic hepcidin causes rapid dose-dependent hypoferremia and is concentrated in

ferroportin-containing organs. Blood. 2005; 106(6):

2196-9.

9. Terpe K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and

biochemical fundamentals to commercial systems. Appl

Microbiol Biotechnol. 2006; 72(2): 211-22.

10. Gerardi G, Biasiotto G, Santambrogio P, Zanella I, Ingrassia R, Corrado M, et al. Recombinant human hepcidin expressed in Escherichia coli isolates as an iron

containing protein. Blood Cells Mol Dis. 2005; 35(2):

177-81.