یوؽبّ ردبً
يَدؾًاد یعبٌؽربک ذؽرا يرٍبٌف تغیس یکؽشپ
،
ُذکؾًاد يف يرٍآ يبّ يیًَ ،یکؽشپ ُبگؾًاد مَلػ
یکؽشپ ،ىبتغلگ ،ىبگزگ ىازیا
یًادشی ةَقعی
ربیدبتعا یٌویا یعبٌؽ ،یکؽشپ شکزه تبقیقحت
يربویث يبّ یًَفػ ٍ شکزه تبقیقحت مَلػ
ُبگؾًاد ،یّبگؾیبهسآ مَلػ
یکؽشپ ،ىبتغلگ ،ىبگزگ
ىازیا
یًادشی ةَقعی :لَئغه ُدٌغیًَ
تغپ :کیًٍزتکلا
:يفلت
09125757292
:طردآ
یکؽشپ مَلػ ُبگؾًاد ،يیًَ يبّ يرٍآ يف ُذکؾًاد ىازیا ،ىبگزگ ،ىبتغلگ
:تفبیرد 31 / 2 / 33
ؼیازیٍ :یًبیبپ 6 / 4 / 33
:ػزیذپ 10 / 4 / 33 ُدیکچ
:فدّ ٍ ٌِیهس لپیتلبه
ظیسٍزلکعا کی
تعا يهشه یثبْتلا يویادَخ يربویث .
لفا يیئتٍزپ یعبخه قیرشت ىصًََویا توغق ِث لقته يیلیه ی
يیغکَت تذؽ ذًاَت یه ازلک
يیئتٍزپ يیا ذیلَت يازث .ذّد ؼّبک ار ظیسٍزلکعا لپیتلبه ىاربویث رد یٌویا خعبپ تیکزت عًَ ،تعبٌه یًبیث ىبثشیه ةبختًا ،َُجًا طبیقه رد تیکزتًَ يبّ ـخبؽ يذٌث
يذیتَئلکًَ یلاَت ىدزک ٌِیْث ،ُذؽ لقته تلبح رد يیئتٍزپ ٍد ییبضف ربتخبع ،یٌیئتٍزپ ؼًاَخ يبّ ىٍذک ىدَث ربگسبع ػبحل سا (
CAI ياَتحه ٍ ) GC
یه تیوّا شئبح ربیغث ،
ذؽبث .
ػٍر ىعرزب : يبّراشفا مزً سا ُدبفتعا بث ِؼلبغه يیا رد DNA2
،
PSIPRED ٍ
ProtParam .تفزگ رازق یثبیسرا درَه تیکزتًَ يیئتٍزپ ذیلَت يازث يکوه تلبح يیزتْث
لفا يیئتٍزپ حیحف ؼًاَخ ،يیازث ٍُلاػ ىصًََویا توغق ِث لقته يیلیه ی
يیغکَت ازلک
مزً ػٍر ِث ُذٌٌکذک ِؼغق يذهآربکسا ىبٌیوعا لَقح سا ظپ .تفزگ رازق ِخَت درَه شیً ػربفع شتٌع يازث ُذٌٌکذک ِؼغق ،يراشفا ُذؽ یحازع ِؼغق یثبیسرا رَظٌه ِث. ذؽ ُداد
يبّزویازپ سا ُدبفتعا بث یًصزیثکت ىَهسآ T7
ُذؽ یحازع ِؼغق تیبًْرد .تفزگ مبدًا
یًبیث رَتکٍ گٌیًَلک لحهرد pET28
.تفزگ يبخ
بّ ِتفبی
: ىاشیه ،ُذؽ یعذٌْه ُذٌٌکذک ِؼغق يسبع ٌِیْث ساذؼث CAI
سا 64 ِث ذفرد
80 ياَتحه ٍ ذفرد GC
سا 41 ِث ذفرد 49 دٍذح ذًبث رَضح .دزک اذیپ بقترا ذفرد
700bp ػٍر ِث ُذؽ ِتخبع تیکزت ًَ رَتکٍ یعرزث سا لفبح سرَفٍزتکلا يَگلا رد یًبیث رَتکٍ گٌیًَلک لحهرد زظً درَه ِؼغق حیحف گٌیًَلک ُذٌّد ىبؾً ،یًصزیثکت
pET28 .ذؽبث یه
تً :ىزیگ ِجی ُذؽ یحازع ِؼغق ذّد یه ىبؾً یّبگؾیبهسآ ٍ يراشفا مزً تبؼلبغه
.تعا ِعَثزه تیکزتًَ يیئتٍزپ ىدزکذک ِث ردبق يکوه تلبح يیزتْث رد لابوتحا صاٍ یبّ ُ یدیلک : ،ظیسٍزلکعا لپیتلبه يیغکَت
،ازلک يیلیه یلفا يیئتٍزپ
یًص ُسبع تخبع ٍ یسبع ٌِیْب ،یحازط ُدٌٌکدک
توغق ِب لصته يیلیه یلصا يیئتٍزپ
ىصًََویا يیغکَت
ازلک
یاراد ِبتر یولع
–
یؾٍّضپ
سا ىَیغیوک مَلع تبیزؾً
یکؽشپ رَؾک
:ِلبقه طردآ
یوؽبّ ،ى یًادشی ي
"
ٌِیْث ،یحازع یًص ُسبع تخبع ٍ يسبع
ُذٌٌکذک توغق ِث لقته يیلیه یلفا يیئتٍزپ ىصًََویا
يیغکَت
ازلک
"
شییبپ ،یّبگؾیبهسآ مَلػ ِلده 1393
ُربوؽ(نتؾّ ُرٍد ، 3
:) 8 -14
ِهدقه
سا یکی ظیسٍزلکعا لپیتلبه يربویث
یٌویادَخ يبّ
ِث طَثزه يهشه یثبْتلا رد ِک تعا یٌویا نتغیع
يبؾغ ىآ
لَلع حغع يیلیه ربچد یجقػ يبّ
یه تیزخت دَؽ
( 1 ).
تیعآ يربویث يیا ُذٌٌک دبدیا لهاَػ يیزتوْه سا یکی
يیلیه یلفا يیئتٍزپ
(MBP)
یه .ذؽبث ذیعا يیئتٍزپ يیا رد
يبّ ٌِیهآ 83
بت 99 توغق کیًصًََویا ؽ
ـ ؽ ِتخبٌ ــ ُذ
تعا ِک ٌل ــ تیعَف يبّ
T
ٍ
B
ٍ ُذؽ لقته توغق ىآ ِث
ؼٌکاٍ يبقلا ثػبث یه یٌویادَخ يبّ
ذًَؽ ( 3 ). ىٌَکبت
لپیتلبه يربویث يازث یؼغق ىبهرد کعا
ظیسٍزل ِتخبٌؽ ُذؾً
ٍ زتؾیث ىبهرد يبّ زضبح ِک ِث ذییبت
FDA
ُذیعر ذًا ِث
ترَف نئلاػ یًبهرد ٍ بث ةَکزع نتغیع
یٌویا ثػبث
تیفیکدَجْث یگذًس
ىاربویث یه دَؽ . ةَکزع نتغیع
یٌویا تیبؼه ُذوػ ییا ىَچ ؼّبک ییبًاَت نتغیع یٌویا
رد ِلثبقه بث زگید يربویث بّ ٍ تًَفػ بّ ار ِث لبجًد
دراد ( 4 .) یکی سا ِجٌخ يبّ ربیغث يیًَ رد لزتٌک يیا
يربویث دبدیا تلبح یث یخعبپ بی لوحت تجغً ِث لهبػ
دبدیا ُذٌٌک يیا يربویث بی ىبوّ یتًآ ىص
MBP
ذؽبث یه .
ػٍر ِث تجغً یًبهرد ػٍر يیا نْه يبّ تیشه سا يبّ
یًبهرد نئلاػ ،
عًَ يیا ًِازگؾیپ تلبح ٍ ىدَث یفبقتخا
نتغیع ُذٌٌک ةَکزع يبٍّراد تیبؼه ِک تعا ىبهرد
دراذً ار یٌویا (
5 ) . لَلع ؼیاشفا یخعبپ یث يبقلا يازث
يبّ لَلع تیلبؼف ؼّبک ٍ زگ نیظٌت يبّ
Th1
ىاشیه ٍ
يدبث یتًآ يیزتوْه ِلوخ سا يدَخ يبّ
یه بّدزکیٍر
زگید يبّ ِجٌخ سا .ذؽبث ،
ىدزک فزحٌه ِث یٌویا خعبپ
لَلع توع يبّ
Th2
ذؽبث یه حؽزتبث بّ لَلع يیا .
يبّ يیبکَتیبع
TGF-B
،
IL-4
ٍ IL10
خعبپ ؼّبک ثػبث
ةزخه يبّ لَلع
Th1
لع ٍ ــ ّ لَ ــ ع يب ــ کیغکَتَتی
ه ـ ؽ ی َ د ( 7،6 .) توغق
B
يیغکَت يیزتْث سا یکی ازلک
لَلع توع ِث یٌویا خعبپ ُذٌٌک لیذؼت يبّ ىص یتًآ يبّ
Th2
یه .ذؽبث يیغکَت حؽزت ازلک َیزجیٍ يزتکبث سا ازلک
يیا دَؽ یه يیغکَت
ذحاٍ زیس ٍد ياراد
A
ٍ
B
یه .ذؽبث
غق ـ تو
A
زیس ٍ يدزکلوػ ذحاٍ اس تیهَوغه
ٍ
B
ک ث ِ ــ ِ
ف ــ ـ ترَ پ ـٌ ــ تـ هب ــ ز عا ـــ ت ث ـ ِ ٌػ ـ یس ىاَ ـ حاٍز ـ ــ غ ذ ــ ی ــ ز تـ
کیغکَ یه ِتخبٌؽ
.دَؽ زیس زّ توغق سا ذحاٍ
B
يیغکَت ياراد ازلک 124
یه ٌِیهآ ذیعا ذؽبث
ُذّبؾه .
ىص یتًآ بث يیئتٍزپ يیا ِک یهبگٌّ ُذیدزگ زگید يبّ
ِگٍضًَک دَؽ
ت تبًاَیح ِث یکارَخ ترَف ِث ٍ ـ
قیرش
ؽ دَ ث ــ دیا ثػب ــ ت دب ـ ىآ ِث تجغً لوح آ
یه ىص یتً
ددزگ ( 8 ). لبقتا يازث ُذؽ حزغه يبّدزکیٍر سا یکی
يیئتٍزپ رد بّ يیئتٍزپ تیکزتًَ ، يبّ ػٍرسا يزیگ ُزْث
لبقتا .ذؽبث یه ییبیویؽ يیئتٍزپ ییبیویؽ
ىَچ یجیبؼه بّ
ِث ىبکها ٍ يیئتٍزپ رد کیًص یتًآ تلبح ىذهآ دَخٍ
(دراد ُازوّ ِث ار لبقتا ىدَث راذیبپبً 9
يیا زث ِجلغ يازث .)
یه تلاکؾه ترَف ِث ار يیئتٍزپ ٍد يیا ىاَت
يیئتٍزپ
تیکزتًَ .دزک ذیلَت
ٍد يیا یًص تبؼغق لبقتا بث ربک يیا
یه مبدًا تعبٌه ىبثشیه رد يیئتٍزپ ذیلَت ٍ ىص .دزیگ
يازث
لَت يزتکبث سا ىاَت یه َُجًا طبیقه رد يیئتٍزپ ذی ُدبفتعا بّ
یًص یلاَت ربکٌیا يازث .دزک يیئتٍزپ
تیکزتًَ يازث یتغیبث
ددزگ ٌِیْث ىبثشیه رد ىبیث (
10 ) يزتکبث يیزتْث سا یکی . يبّ
يزتکبث ُذؽ یعذٌْه
(DE3)E.coli BL21
بث ِک تعا
لهبح یًبیث يبّ
pET
راد يربگسبع .د
بث ِؼلبغه يیا رد
ثـ يتفزگ زظً رد ٍ يراشفا مزً یعرز زیغته
يبّ
CAI(Codon Adaptation Index)
، ياَتحه
GC
ٍ
ةبختًا ُذٌّد لبقتا یحازع يا ُذٌٌکذک ِؼغق ،
ؽ رد ِک ذ
تعبٌه ؼًاَخ يَگلا ذًاَت یه
ـخبؽ يبّ یپَت یپا
یویظٌت خعبپ توع ِث یٌویا خعبپ زییغت يازث ار زظً درَه
.ذیبوً نّازف
یعرزب ػٍر
یلاَت اذتثا رد يا ٌِیهآذیعا
ٍ يیلیه یلفا يیئتٍزپ
بتث توغق يیغکَت
تیبع سا ازلک
NCBI
ٍ
UNIPROT
ذخا
.ذؽ ظپع توغق کیًصًََویا يیلیه یلفا يیئتٍزپ
ِک
تیعَفٌل ظعَت يبّ
B
ٍ
T
تفزگ یه رازق نخبْت درَه
ـخؾه .ذیدزگ ُذٌٌکذک ِؼغق ِتفزیذپ ترَف یحازع رد
یلاَت ِث طَثزه بوٌّار
ي يیغکَت ازلک سا زظً درَه یلاَت
ح رَظٌه ِث .ذؽ فذح ـ
ربتخبع ؼف ییبضف
ؽ ــــ خب ــ ـ بّ سا
تا ــ لبــق ّد ــ ٌ ـــ ّ ُذ ــــ يب ع ـــ خ ــ ت ک ــــ ِ ع ـــ خب ـــ ت ــ رب
ُرٍد ،یّبگؾیبهسآ مَلع ِلجه نتؾّ ُربوؽ( 3 ) شییبپ 33 لآ ــ ف بـ ّ ــ یل ــ ک ـ ظ ت ـ ؾ ــ ک ی ــ ل ه ــ ی ّد ــ ذ عا ــ تـ ف ـ ُدب گ ــ یدز ــ ذ (AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK) . ثـ ـ ِ ه ـٌ ــ ظ ـ رَ ـیلـخت يـیئتٍزـپ زث ِیبپ ىَتع یفازگَتبهٍزک یثذخ ( ىَتع لکیً ) 6 دذػ یلاَت يیذیتغیّ رد توغق N لبٌیهزت ِفبضا ذیدزگ . ذؼث سا یلاَت يبّ يیذیتغیّ یلاَت طَثزه ِث ُبگیبخ ػزث نیشًآ سبٌیکٍزتًا تفزگرازق . يازث ػزث یلاَت يذیتَئلکًَ مبگٌّ ىدادرازق رد ،لهبح نیشًآ يبّ دٍذحه ُذٌٌک Nco1 رد توغق N لبٌیهزت ٍ Xho1 رد يبْتًا C لبٌیهزت ِفبضا ذؽ . بث ُدبفتعا سا مزً راشفا یکیتبهرَفًاَیث DNA2 ٌِیْث ىدزک یلاَت يذیتَئلکًَ ترَف تفزگ . يازث يیا ربک ىٍذک ییبّ ار ِک رد يزتکبث درَه زظً زتؾیث درَه ُدبفتعا رازق یه تفزگ ةبختًا ذؽ يیٌچوّ یلاَت يبّ يرازکت GC شیً درَه یثبیسرا رازق تفزگ ٍ ُبگیبخ يبّ ػزث یویشًآ رد یلاَت شیً یعرزث ذؽ . مزً راشفا psipred يازث ؼیــپ یٌیث ربتخبــع ِیًَبث يیئتٍزپ ٍ مزــً راشــفا ProtParam يازث يییؼت ىاشیه يراذیبپ يیئتٍزپ تیکزتًَ ُدبفتعا ذؽ . شتٌع ىص ٌِیْث ،ُذؽ ظعَت تکزؽ ShineGene يیچ مبدًا ذیدزگ . ِؼغق شتٌع ُذؽ ياراد یلَع ِث ُساذًا 498 تفخ سبث دَث . يیا ىص ِث ترَف ىَلک ُذؽ رد رَـتکٍ pUC57 تـفبـیرد ـؽ ــ ذ . ـپ ــ ظ سا ـیرد ـ تفب لهبح ػربفـع ُداد ؽ ــ ،ُذـ ـع ــ ی ذٌیآزــف ـؽ ـ کَـ ح ــ ترازـ ــ ی (
Heat shock transformation
) لهبــح ِــث ىٍرد يزتـکبـث ذـؼـتـغـه XL1blue لقتٌه ِخَت بث .ذیدزگ
رد يیلیع یپهآ ِث تهٍبقه ىص رَضح ِث لهبح
ٍ زظً درَه
ح ـ پهآ رَض ـ یًَلک ،يزتکبث ذؽر تؾک ظیحه رد يیلیع ی
حیحف سزع ِث ِک ییبّ لبقتًا
.ذیدزگ ةبختًا دَث ُذؽ
(ذیوعلاپ جازختعا تیک سا ُدبفتعا بث ظپع تکزؽ
،)ىصبیک
.ذًذؽ جازختعا ِتفبی زیثکت يبّذیوعلاپ ا ظپ
س سا ىبٌیوعا
ؼٌکاٍ ،ُذؽ جازختعا ذیوعلاپ تعبٌه تیفیک نضّ
يبّ نیشًآ بث یویشًآ
NcoI ٍ XhoI تکزؽ( vivantis زث )
.ذؽ مبدًا بّذیوعلاپ يٍر ،ُذؽ یحازع ِؼغق ػزث سا ظپ
ذیوعلاپ
pET28
ِث ُذؽ ُربؽا يبّ نیشًآ سا ُدبفتعا بث شیً
ٍ ُذؽ ُدرَخ ػزث ِؼغق ظپع .ذهآرد یغخ ترَف لهبح
سربگآ لص يٍر زث ُذؽ یغخ کی
رد .ذؽ يسبعاذخ ذفرد ىبیبپ
ِؼغق ٍ یًص هبح ـ ل تیک سا ُدبفتعا بث ُذؽ یغخ
تکزؽ ىصبیک سٍربگآ لص يٍر سا کی
ـیلخت ذفرد
ظپع .ذیدزگ لبقتا
ىٍرد ِث ُذؽ یحازع ِؼغق ُبگیبخ
گٌیًَلک لهبح
pET28
تْخ .تفزگ مبدًا لبقتًا
لَقحه
لبقتا
pET28a
تیحلاف يبّ لَلع ىٍرد ِث
راد
EcoliBL21
ذؽ ُدبفتعا یترازح کَؽ ػٍر سا .
ُذؽ لبقتًا يبّ يزتکبث تیلپ يٍر زث
LB
يیغیبهبًبک يٍبح
ذیوعلاپ( ذًذؽ ُداد تؾک
pET28a
ِث تهٍبقه ىص ياراد
.)تعا يیغیبهبًبک ،یًصزیثکت ؼٌکاٍ مبدًا يازث
لهبح
لاپ جازختعا تیک سا ُدبفتعا بث تیکزتًَ يزتکبث سا ذیوع
يبّ لبقتًا يیا .ذؽ اذخ ُذؽ لهبح
یًص يَگلا ىاٌَػ ِث بّ
.تفزگ رازق ُدبفتعا درَه یًص زیثکت ؼٌکاٍ رد ؼٌکاٍ
ییبهد ظیازؽ تحت زیثکت :
تذه ِث ِیلٍا یتؽزعاٍ 5
ِقیقد
رد 95 داذؼت ِث ٍ ،رٍد کی يازث دازگ یتًبع ِخرد 30 رٍد تذه ِث 50 رد ِیًبث 95 ِخرد ،دازگیتًبع 40 رد ِیًبث 46 ِخرد ،دازگیتًبع 60 رد ِیًبث 72 ىبیبپ رد ٍ دازگیتًبع ِخرد 5
ِقیقد
رد 72 تفزگرازق ییبًْ ػزتغگ ىاٌَػ ِث ِخرد .
تْخ
مبدًا ؼٌکاٍ يبّزویازپ سا ،یًصزیثکت
T7 .ذؽ ُدبفتعا
بّ ِتفبی
ؾً حیبتً ـ ح ُذٌّد ىب ــ
ّ رَض ــ ؼغق ِو ــ مسلا یًص تب
رد لا ــ خ يَگ ــ ف ؼًاَ ـ یح ـ ح ه رد ــ یـ ث ىبثش ــ کب ت ــ یز ــ یب ــ ی
لٍذخ(ذؽبث یه 1
ظپ .) سا یحازع ٍ تفبیرد لهبح تیکزتًَ PUC57 ، يبّ لهبح تیکزتًَ ِث ىٍرد يزتکبث يبّ تیحلاف راد XL1blue لبقتًا ُداد ذًذؽ . يزتکبث يبّ لبقتًا ُذؽ يٍر ظیحه ربگآ يٍبح یپهآ يیلیع تؾک ُداد ذؽ . یٌلک يبّ ذیفع لفبح سا يزتکبث يبّ لبقتًا ُذؽ ٍ قه ب مٍ ِث یپهآ يیلیع ًلابوتحا یًص ِؼغق ار ِث ىاٌَػ کی ىص یخربخ ِتفزیذپ ذًا . یعرزث لهبح تیکزتًَ بث ُدبفتعا سا نیشًآ يبّ زثلاادٍذحه NcoI ٍ XhoI ٍ رَضح ذًبث دٍذح 500 تفخ يسبث ذییبت ُذٌٌک رَضح ِؼغق یًص یحازع ُذؽ تعا لکؽ( 1 ). ظپ سا ػزث یویشًآ ٍ جازختعا یلاَت یًص درَه زظً سا ،لص ةبع گٌیًَلک ِؼغق یحازع ؽ ــ ُذ ِث ىٍرد لهبح pET28 ترَف تفزگ . ظپع يزتکبث يبّ تًا ــ لبق ؽ ــ ُذ بث هبـــح ل تًَ ــ یکز ــ ت يٍر پ ــ یل ـــ ت گآ ــ رب
يٍبح ک
ـ هبًب ــ یـ یغ ــ ي ک ـ ؾ ــ ت ُداد ؽ ـ ًذ ــ ذ .
علاپ ـ و ـ حذی ـ فب ــ ل کسا ـل ـ یٌ ّ ــ يب ؽر ــ فبیذ ــ ِت ث ــ ب
عا ـت ـ ُدبف سا ػٍر کت ـ زیث ًص ــ ی ٍ ّ ــ ض ــ ن ًآ ــ یش ـ و ـ ی ه ـ درَ ث
ــ عرز ــ ی ق ــ راز گ ــ فز ــ ت . ح ــ رَض ث ــ ذًب 700 فخ ــ ت يسبث
رد لا ـــ يَگ لا ــ فٍزتک ــ سرَ ؾً ــ ىب ّد ــ ُذٌ ف ــ ذٌیآز حیحف
ةبع گٌیًَلک یه
ذؽبث لکؽ( 2 ).
لکؽ 1 دیوعلاپ یویشًآ نضّ
PET28
یبّ نیشًآ بب
NcoI
ٍ
XhoI
سٍربگآ لص یٍر زب 1
دصرد
1 ُدؾً نضّ دیوعلاپ ) 2
ُدرَخ ػزب دیوعلاپ ) 3
زکربه )
DNA
ىدزک ٌِیْب سا لبق یدیتَئلکًَ یلاَت ىدزک ٌِیْب سا دعب یدیتَئلکًَ یلاَت ٌِیها دیعا یلاَت نیشًا
زثلاادٍدحه
NCO1
5’---C CATGG---3’ 3’---GGTAC C---5’
5’---C CATGG---3’ 3’---GGTAC C---5’
M
یلاَت يیدیتغیّ
CACCATCATCACCACCAC CACCATCATCACCACCAC HHHHHH
ػزب ُبگیبج نیشًا سبٌیکٍزتًا
GACGACGACGACAAA GACGACGACGACAAA DDDDK
توغق ىصًََویا
يیغکَت ازلک
)CTXB)
ACCCCGCAGAACATCACCGACCTGTGCG CTGAATACCACAACACCCAGATATACACC CTGAACGACAAAATCTTCTCTTACACCGA ATCTCTGGCTGGTAAACGTGAAATGGCT ATCATCACCTTCAAAAACGGTGCTATCTT CCAGGTTGAAGTTCCGGGTTCTCAGCAC ATCGACTCTCAGAAAAAAGCTATCGAAG TATGAAAGACACCCTGCGTATCGCTTACC
TGACCGAAGCTAAGTTGAAAAACTGTGC GTTTGGAACAACAAAACCCCGCACGCTA
TCGCTGCTATCTCTATGGCTAAC
ACCCCGCAGAACATCACCGACCTGTGCG CTGAATACCACAACACCCAGATATACACC CTGAACGACAAAATCTTCTCTTACACCGA ATCTCTGGCTGGTAAACGTGAAATGGCTA TCATCACCTTCAAAAACGGTGCTATCTTCC AGGTTGAAGTTCCGGGTTCTCAGCACATC GACTCTCAGAAAAAAGCTATCGAACGTAT GAAAGACACCCTGCGTATCGCTTACCTGA CCGAAGCTAAAGTTGAAAAACTGTGCGTT TGGAACAACAAAACCCCGCACGCTATCGC
TGCTATCTCTATGGCTAAC
TPQNITDLCAEYHNTQI YTLNDKIFSYTESLAGK
RE
MAIITFKNGAIFQVEVP GS
QHIDSQKKAIERMKDTL RI
AYLTEAKVEKLCVWNN KTPHAIAAISMAN
زکٌیل GCTGAGGCTGCCGCTAAGGAAGCAGCA
GCAAAGGAAGCGGCGGCTAAAGAAGCT GCTGCTAAAGCT
GCTGAGGCTGCCGCTAAGGAAGCAGCAG CAAAGGAAGCGGCGGCTAAAGAAGCTGC
TGCTAAAGCT
AEAAAKEAAA KEAAAKEAAAKA
يیئتٍزپ
ا
يیلیه یلص
)MBP)
GAAAACCCGGTTGTTCACTTCTTCAAAAA CATCGTTACCCCGCGTACCCCG
GAAAACCCGGTTGTTCACTTCTTCAAAAACA TC
GTTACCCCGCGTACCCCG
ENPVVHFFKNIVTPRTP
ىٍدک
ىبیبپ TAATGA TAATGA
نیشًا زثلاادٍدحه
XHO1
5’---C TCGAG---3’ 3’---GAGCT C---5’
5’---C TCGAG---3’ 3’---GAGCT C---5’
LE
لٍدج 1 -ُدؽ یحازط يیئتٍزپ ىصَیف لهبک ییا ٌِیهآ دیعا ٍ یدیتَئلکًَ یلاَت
ُرٍد ،یّبگؾیبهسآ مَلع ِلجه نتؾّ
ُربوؽ( 3 ) شییبپ 33
ثحب
بتث توغق تیکزت يیغکَت
يیلیه یلفا يیئتٍزپ ٍ ازلک
رد یٌویا دَخ ذح سا ؼیث خعبپ سا يزیگَلخ يازث ذًاَت یه
رازق ُدبفتعا درَه ظیسٍزلکعا لپیتلبه ىاربویث يازث .دزیگ
تـ یلَ ـ پ ذ ــ ه رد يیئتٍز ــ
جًا طبیق ــ ىبثشیه کی ِث سبیً َُ
ذؽبث یه تعبٌه .
يزتکبث
BL21
ِیاذخسا یکی یعذٌْه يبّ
يازث ُذؽ ذیلَت
يیئتٍزپ تیکزتًَ یه
ذؽبث . يبّسبئتٍزپ يیا
يزتکبث ؼْخ ِتفبی ُذؽ ٍ رد ِدیتً یجیعآ ِث يیئتٍزپ ذیلَت
ُذؽ ذّاَخً تؽاد . يیا ِیاذخ بث لهبح يبّ
PET
يربگسبع
دراد . یکی عاًَاسا يیا لهبح بّ
PET28a
یه ذؽبث ِک
ياراد ىص تهٍبقه ِث يیغیبهبًبک يازث
يزگلبثزغ ،ىبعآ
زتَهٍزپ
T7
يازث ذیلَت َُجًا يیئتٍزپ ٍ
His tag
يبْتًارد
C
ٍ
N
لبٌیهزت يازث ـلبخ يسبع ىبعآ یه ذؽبث . لهبح
PET28a
ِث تلػ يتؽاذً
tag
يبّ یحؽزت يیئتٍزپ
ً ــ کزتَ ــ تی ار ث ــ ِ ف ــ ترَ ًا ــ ىَیسَلک يدبث
ذیلَت یه
ذیبوً ( 11 .) یه ىبؾً یلجق تبؼلبغه ىدزک ِفبضا ِک ذّد
ذیتپپ بتث توغق یٌیهآ يبْتًا ِث يیغکَت
یه ازلک ذًاَت ثػبث
زییغت ربتخبع ٍ دزکلوػ ددزگ ىآ ( 12 ) . طَثزه یلاَت يیازثبٌث
بتث توغق ِث يیغکَت
توغق رد ازلک
N
لبٌیهزت يیئتٍزپ
تیکزتًَ رازق
سا زتْث يسبع ـلبخ يازث يیٌچوّ .تفزگ
یلاَت 6 توع رد يیذیتغیّ ییبت
N
.ذؽ ُدبفتعا لبٌیهزت
ت ىدزکاذخ يازث ــ
سا ذؼث يیذیتغیّ یلاَ يسبع ـلبخ
رازق سبٌیکٍزتًا نیشًآ ػزث ُبگیبخ ربیغث نیشًآ يیا.ذؽ ُداد
خا ــ ػ یفبقت ــ
ٌک یه لو ــ
ذ ق ٍ ــ خ ترذ ــ ک اذ ــ ىدز
ت ــ ّ یلاَ ــ غی ــ ه اراد ار يیذیت ـ
ی ث ــ ث .ذؽب ــ ه ِ ــ ح رَظٌ ــ ؼف لخاذت مذػ ٍ ِلفبف
ـخبؽ يیث دزکلوػ رد يبّ
يیئتٍزپ
ًَ يذیتپپ يبّ ُذٌّد لبقتا سا ُذؽ تیکزت ذؽ ُدبفتعا
.
ُذٌّد لبقتا ىبققحه یه نیغقت عًَ ِع ِث ار بّ
ذٌٌک .
ُذٌّد لبقتا يبّ
فبغؼًا زیذپ
flexible)
) ، تفع (
rigid
) ٍ
لثبق يبّ ُذٌّد لبقتا تغکؽ
(
cleavable
). ُذٌّد لبقتا
ِک یًبهس زیذپ فبغؼًا يبّ ـخبؽ
ذٌّاَخث یٌیئتٍزپ يبّ
يیا .دراد دزثربک ذٌؽبث ِتؽاد يؾکازتٌیا ٍ لخاذت زگیذوّ بث
ُذٌّد لبقتا هس
ــ ک یًب ـ رد ِ بّ يیئتٍزپ ي
تیکزتًَ ُدبفتعا
تعا يکوه دَؾث لخاذت ثػبث
ـخبؽ ِدیتً رد ٍ نّ بث بّ
حَت یپا ییبعبٌؽ مذػ يبّ
ـخبؽ يدبث یتًآ ظعَت بّ بّ
.دَؽ ُذٌّد لبقتا لثبق يبّ
ظیحه رد شیً تغکؽ
in vivo
ییاذخ ثػبث ـخبؽ
سا بّ یه زگیذوّ ِلفبف ؼفح .دَؽ
يیئتٍزپ ٍد يیث لَلع بث ییبعبٌؽ ذًٍر رد لخاذت مذػ يازث
.تعا مسلا یٌویا يبّ ُذٌّد لبقتا
تخع يذیتپپ يبّ
(
rigid
) ث ٍ ذٌّد یه لیکؾت ظکیلّبفلآ ربتخبع ِ
یثَخ
ِلفبف ؼفح ثػبث ـخبؽ
بّ رد يیئتٍزپ تیکزتًَ یه
دَؽ ( 13 ) راشفا مزً سا ُدبفتعا بث .
psipred
لیکؾت تحف
يیا ظکیلّ بفلآ ربتخبع ُذٌّد لبقتا
.ذؽ ذییبت یلاَت
يذیتَئلکًَ ِث طَثزه
يیئتٍزپ تیکزتًَ راشفا مزً بث
DNA2
ْث ــ یدزگ ٌِی ــ ث .ذ ــ سا ُدبفتعا ب يربگسبع راشفا مزً يیا
ىٍذک ؼًاَخ يبّ (
CAI
) ياَتحه ٍ
GC
ِؼغق ِث طَثزه
درَه ُذٌٌکذک حیبتً .تفزگ رازق یثبیسرا
CAI
زّ رذقچ ِث
100 ذؽبث کیدشً ذفرد رد ىبیث يازث
تعبٌه ىبثشیه زت
عا ـ ت . اَتحه مٍد درَه ي
GC
.تعا یلاَت زّ
رذقچ ذفرد
لکؽ 2 -یعرزب جرد تحص ىص ظًبکع
طعَت یبّزویازپ
T7
ٍ ِب ػٍر
PCR
. 1 ) دًبب 700 یسبب تفج ىبؾً ُدٌّد ِعطقرَضح
ُدٌٌکدک تعا . 2 ) زکربه
DNA
. 3 یفٌه لزتٌک )
GC
ث ــ لاب ث ــ ؽب ــ ًا ِث ذ ــ یث يصز ــ تؾ ــ ث يز ــ ث ياز ــ کسب ــ ىدز
ٍد ؽر ــ ت ــ ِ
DNA
ا س ّ ــ یً ن ــ سب تعا ( 14 ) ث . ــ ٌ ــ يیازثب
ث ــ ْ ــ زت عا ــ ه ت ــ راذق
GC
یس ــ ز 70 فرد ــ ذ ث ــ ؽب ـــ ذ .
ق ــ ج ــ ث سا ل ــ یْ ــ ه ىدزک ٌِ ــ
ی ــ ىاش
CAI
ت ــ ً یلاَ ــ کزتَ ــ تی
ح رد ــ ع تلب ــ ،ىص یؼیج 64
فرد ــ ث ذ ــ ک دَ ــ ث ِ ــ سا ذؼ
ث ــ ْ ــ ىدزک ٌِی ِث
ىاشیه ٌه ربیغث ــ عب ــ ت 80 د فر ــ ذ ْث ــ دَج
پ ــ ک اذی ــ ه ٍ دز ــ راذق
GC
سا 42 فرد ــ ث ذ ــ ِ 49 فرد ــ ذ
فا ــ یاش ــ ی ؼ ــ ً .تفب ــ فا مز ــ راش
ProtParam
ؼت يازث ـ یی ـ ي
پـ یب ـ پ يراذ ـ ئتٍز ـ عا يی ـ فت ـ ؽ ُدب ــ پ .ذ ــ زتهارب
Instability
Index(II)
ث ــ ق ياز ــ ـ ع ِؼغ ـ حاز ــ ؽ ی ــ قه ُذ ــ ػ راذ ــ يدذ
32 ً ار ــ ه ىبؾ ــ ذّد ی ک ـ یا ِ ــ یه ي ــ ث ىاش ــ پ ياز ــ يراذیب
قـ ــ ـ غ ــــ ؼ ــ ع ِ ـــ ـ حاز ـــ ؽ ی ـــ ه ُذ ــ ٌ ــ عب ــــ عا ت ـــ ت ( 1 .)
9. Frankel AE. Immunotoxins. Springer. 1988.
10. Sørensen HP,Mortensen KK. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of biotechnology. 2005; 115(2): 113-28.
11. Marisch K, Bayer K, Cserjan-Puschmann M, Luchner M, Striedner G. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production. Microbial cell factories. 2013; 12(1): 58.
12. Dertzbaugh M, Elson C. Reduction in oral immunogenicity of cholera toxin B subunit by N-terminal peptide addition. Infection and immunity. 1993; 61(2): 384-90.
13. Chen X, Zaro JL, Shen W-C. Fusion protein linkers: Property, design and functionality. Advanced drug delivery reviews. 2013; 65(10): 1357-69.
14. Welch M, Govindarajan S, Ness JE, Villalobos A, Gurney A, Minshull J, et al. Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli. PloS one. 2009; 4(9): e7002.
15. Guruprasad K, Reddy BB, Pandit MW. Correlation between stability of a protein and its dipeptide composition: a novel approach for predicting in vivo stability of a protein from its primary sequence. Protein Engineering. 1990; 4(2): 155-61.
یزیگ ِجیتً
ِیبپزث یعرزث يیتغخً ِؼلبغه يیا ،دَخَه یولػ غثبٌه
ػراشگ تخبع ٍ يسبع ٌِیْث ،یحازع ؿَقخرد لهبح
تیکزتًَ ياراد
ُذٌٌک ذک تبؼغق یلفا يیئتٍزپ ِث طَثزه
تیکزت يیلیه بتث توغق بث ُذؽ
يیغکَت .ذؽبث یه ازلک
زکؾت ٍ یًادردق
یا ي قه ـــ ِلب سا ه ــ لح تیبوح یلبه ترَف ِتفزگ ظعَت
ُبگؾًاد مَلػ یکؽشپ ىبتغلگ ِث ُربوؽ ِهبً 1790 / 35
ترَف ِتفزیذپ تعا . يیٌچوّ سا تبوحس ىاربکوّ شیشػ
ربکزع نًبخ زتکد زلیآ ،یلبوخ نًبخ ُربع ًص ــ ذ ٍ يبقآ
عا ــ لیػبو وف ــ ىبیذ ک ــ ِ رد دًا ــ مب ،ربک وک ــ ک ؽ ــ یًبیب
ً ــ ًدَو ــ ذ ت ـ کؾ ــ ز ٍ یًادرذق یه نییبوً .
References
1. Goldenberg MM. Multiple sclerosis review. Pharmacy and Therapeutics. 2012; 37(3): 175-184.
2. Flachenecker P. Epidemiology of neuroimmunological diseases. Journal of neurology. 2006; 253(Suppl 5): v2-v8.
3. Bielekova B, Goodwin B, Richert N, Cortese I, Kondo T, Afshar G, et al. Encephalitogenic potential of the myelin basic protein peptide (amino acids 83–99) in multiple sclerosis: results of a phase II clinical trial with an altered peptide ligand. Nature medicine. 2000; 6(10): 1167-75.
4. Loma I, Heyman R. Multiple sclerosis: pathogenesis and treatment. Current neuropharmacology. 2011; 9(3): 409-416.
5. Turley DM, Miller SD. Prospects for antigen-specific tolerance based therapies for the treatment of multiple sclerosis. Results Probl Cell Differ. 2010; 51: 217-35. 6. Holmøy T. Immunopathogenesis of multiple sclerosis: concepts and controversies. Acta neurologica scandinavica. 2007; 115(s187): 39-45.
7. Weiner HL. The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease? Annals of neurology. 2009; 65(3): 239-48.
8. Olivera N, Cédola M, Gómez RM. The Cholera Toxin as a Biotechnological Tool. 2012; DOI: 10.5772/36708.
14
/
یًص ُسبع تخبع ٍ یسبع ٌِیْب ،یحازط . . .ُرٍد ،یّبگؾیبهسآ مَلع ِلجه نتؾّ
ُربوؽ( 3 ) شییبپ 33
Designing, Optimization and Construction of Myelin Basic Protein Coding Sequence Binding to the Immunogenic Subunit of Cholera Toxin
Abstract
Background and Objectives: Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory autoimmune disease. Mucosal feeding of myelin basic protein binding to the cholera toxin B subunit can reduce the intensity of the immune response in MS patients. Expression system, the domain composition of the fusion protein, accessibility of two domains, codon adaptation index (CAI) and GC contents are very important for the large scale production of fusion protein.
Material and Methods: we used DNA2, PSIPRED and ProtParam softwares for designing the best form to produce fusion protein. Moreover, the correct open reading frame of myelin basic protein was also considered. First the coding sequence was verified and then synthesized. For confirmation of the recombinant vector, PCR test was carried out using T7 primers. Finally it was inserted into the cloning site of pET28 expression vector.
Results: After coding optimization, the CAI rate was increased from 64 % to 80% and GC content from 41 % to 49%. The presence of a band near 700bp resulted from PCR amplification test demonstrates the correct cloning of recombinant vectors in the cloning site of pET28 expression vector.
Conclusion: According to software and experimental analysis, the designed sequence probably in the best form could be used for production of recombinant protein.
Keywords: Multiple Sclerosis, Cholera Toxin, Myelin Basic Protein
Hashemi, N. (BSc)
MSc Student of Medical Biotechnology, Faculty of Advanced Medical Technologies, Golestan University of
Medical Science, Gorgan, Iran
Yazdani, Y. (PhD) Assistant Professor of Immunology, Infectious Diseases Research Centerand
Laboratory Science Research Center, Golestan University of Medical Sciences,
Gorgan, Iran
Corresponding Author: Yazdani, Y.
Email: [email protected]
Received: 21 May 2014 Revised: 27 Jun 2014 Accepted: 1 Jul 2014
This paper should be cited as: Hashemi N, Yazdani Y. [Designing, Optimization and Construction of Myelin Basic Protein Coding Sequence Binding to the Immunogenic Subunit of Cholera Toxin]. MLJ. 2014; 8(3):8-14 [Article in Persian]
