DETEKSI CEMARAN SALMONELLA spp PADA DAGING AYAM SEGAR : KAJIAN DIAGNOSA KO-AGLUTINASI
Tesis
Usulan Penelitian
Suryantana Oleh
FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS LAMPUNG
x ABSTRAK
DETEKSI CEMARAN SALMONELLA spp PADA DAGING AYAM SEGAR : KAJIAN DIAGNOSA KO-AGLUTINASI
Oleh : Suryantana
Kejadian penyakit berperantara makanan (food borne disease) masih banyak ditemukan di seluruh dunia termasuk di Indonesia. World Health Organization (WHO) menyatakan bahwa 1 dari 10 menderita sakit atau 33 juta orang sakit setiap tahun karena penyakit berperantara makanan. Salah satu penyebab utama penyakit berperantara makanan adalah cemaran Salmonella spp. Media Centre WHO menyatakan 60-80% kasus salmonellosis tidak dianggap sebagai wabah yang sporadis dan penelitian mengenai cemaran Salmonella spp belum banyak dilakukan. Salah satu kendala pengujian atau deteksi cemaran Salmonella spp, adalah pengujian membutuhkan waktu cukup lama 3-7 hari dengan metoda isolasi dan identifikasi bakteri. Penelitian ini bertujuan menghasilkan perangkat diagnostik secara serologis berupa Kit rapid test dengan metode ko-aglutinasi, untuk mendeteksi cemaran Salmonella spp pada daging ayam. Metode penelitian secara garis besar dibagi menjadi dua tahapan kegiatan utama, yakni tahapan pembuatan kit rapid test ko-aglutinasi yang meliputi penyiapan antiserum, isolasi immunoglobulin G, pengukuran titer antibody yang dihasilkan, penyiapan protein A Staphylococcus aureus, dilanjutkan pengikatan (couple) immunoglobulin G (Ig G) dengan protein A Staphylococcus aureus dan tahab mereaksikan dengan isolat Salmonella spp, sampel hasil simulasi cemaran Salmonella spp (yang memiliki beberapa variasi konsentrasi) dan dengan sampel yang dikoleksi dari lapangan guna menguji kinerja kit. Waktu yang diperlukan untuk pelaksanaan uji menggunakan Kit rapid test ko-aglutinasi, mulai tahab preparasi sampel sampai mendapatkan hasil uji hanya sekitar 3 jam. Hasil pengujian positif ditandai dengan adanya aglutinat berbentuk debris pasir pada area koaglutinasi, sebaliknya hasil negatif tidak terlihat aglutinat. Pengukuran Sensitifitas dan spesifitas uji dilakukan dengan membandingkan uji standar kultur bakteri. Hasil pengujian sample simulasi cemaran Salmonella spp Kit Rapid Test mampu mendeteksi cemaran Salmonella spp dengan konsentrasi terendah 1,5 x 103. Pengujian terhadap 55 sampel daging ayamlapang menunjukkan hasil positif dengan Kit Rapid Test Salmonella spp sebanyak 10 sampel dan pengujian dengan kultur bakteri sebanyak 7 sampel. Pengujian menggunakan Kit Rapid Test Salmonella spp tersebut menunjukan sensitifitas pengujian 100 % serta spesifisitas 93,75%. Kit Rapid Test dengan metoda ko-aglutinasi memberikan alternatif pengujian yang efektif dan efisien untuk mendeteksi cemaran Salmonella spp pada daging ayam.
x ABSTRACT
DETECTION OF SALMONELLA spp CONTAMINATION IN FRESH CHICKEN : STUDY OF CO-AGLUTINATION DIAGNOSIS
Oleh : Suryantana
The incidence of food-borne diseases commonly found throughout the world, including in Indonesia. The data from World Health Organization (WHO) show that 1 in 10 become sick and 33 million people die every year due to food-borne diseases. One of the main causes of food-borne diseases is contamination of Salmonella spp. World Health Organization (WHO) Media Center says that 60-80% of cases of salmonellosis are not considered to be sporadic outbreaks and studies about contamination Salmonella spp in chicken is limited. Commonly, Salmonella spp contamination detecting need a long time of 3-7 days by bacterial isolation and identification methods. This study aimed to produce a diagnostic device serologically in the form of a rapid test kit with co-agglutination method, to detect contamination of Salmonella spp in chicken. The research method was divided into two main activities stages. The first stage was the co-agglutination rapid test kits processing which consisted of preparation of antiserum, immunoglobulin G isolation, measurement of antibody titers produced, preparation of Staphylococcus aureus protein A, and pairing of immunoglobulin G (Ig G) with Staphylococcus aureus A protein. The second stage was reacting the kit with Salmonella spp isolates. The time required for the implementation of the test using the co-agglutination rapid test kit about 3 hours. The positive test results were indicated by the presence of aglutinat in the form of sand debris in the coagglutination area, whereas negative results were not seen aglutinat. Measurement of sensitivity and specificity of the test was carried out by comparing standard bacterial culture tests. The test results of simulation samples of Salmonella spp Kit Rapid Test contamination showed that this kit were able to detect contamination of Salmonella spp with the lowest concentration of 1.5 x 103. Diagnostic technique using the Salmonella spp Rapid Test Kit showed 100% testing sensitivity and 93.75% specificity. The Rapid Test kit with co-agglutination method provides an alternative effective and efficient diagnostic for detecting Salmonella spp contamination in chicken meat.
Keywords: Salmonella spp, co-agglutination, food borne disease
DETEKSI CEMARAN
SALMONELLA spp
PADA DAGING AYAM
SEGAR : KAJIAN DIAGNOSA KO-AGLUTINASI
Oleh
Suryantana
Tesis
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar
MAGISTER SAINS
pada
Program Pascasarjana Magister Teknologi Industri Pertanian
Fakultas Pertanian Universitas Lampung
PROGRAM PASCASARJANA
MAGISTER TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN
FAKULTAS PERTANIAN
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bantul, Daerah Istimewa Jogjakarta pada tanggal 5 Juni 1976, sebagai anak keenam dari enam bersaudara, dari Bapak Sukarjan Hadikarjani dan Ibu Mujirahayu. Pendidikan Sekolah Dasar (SD) dijalani di SDN Jetis, Sedayu dan diselesaikan pada Tahun 1989. Sekolah Menengah Pertama (SMP) di SMPN Argomulyo lulus pada Tahun 1992. Sekolah Menengah Atas (SMA) ditempuh di SMAN Argomulyo, lulus pada Tahun 1994. Lulus SMA penulis diterima di Jurusan Teknik Elektro Fakultas Teknik Universitas Yogyakarta pada Tahun 1994. Pada Tahun 1995 diterima di D3 Kesehatan Hewan Fakultas Kedokteran Hewan UGM dan menyelesaikan pendidikan D3 di Tahun 1998. Tahun 1999 penulis memulai pendidikan S1 di Fakultas Kedokteran Hewan UGM dan menyelesaikan pendidikan pada Tahun 2002, selanjutnya melanjutkan Pendidikan Profesi Dokter Hewan hingga lulus dan mendapatkan gelar Dokter Hewan pada Tahun 2004.
ix
SAN WACANA
Alhamdulillah puji syukur kehadirat Allah SWT, karena atas ijin dan hidayah-Nya penulis mampu menyelesaikan studi dan penulisan tesis ini.
Tesis dengan judul “DETEKSI CEMARAN SALMONELLA spp PADA DAGING AYAM SEGAR : KAJIAN DIAGNOSA KO-AGLUTINASI” adalah salah satu syarat kelulusan dan memeperoleh gelar Magister Sains pada Program Pascasarjana Magister Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung. Penyusunan tesis ini berdasarkan dari penelitian pendahuluan yang telah dilakukan analisis beberapa leteratur, dan arahan dari dosen pembimbing.
Dalam kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih kepada semua pihak yang membantu dalam penulisan proposal sehingga penelitian dapat dilakukan sesuai dengan rencana, yaitu :
1. Prof. Dr. Ir. Irwan Sukri Banuwa, M.Si., selaku Dekan Fakultas Pertanian Universitas Lampung yang telah memberikan kemudahan dalam proses menyelesaikan tesis;
x
3. Prof. Dr. Ir. Neti Yuliana, M.Si., selaku pembimbing akademik dan pembimbing utama atas kesediaannya memberikan bimbingan, saran, kritik dan motivasi dalam proses penyelesaian tesis ini;
4. Dr. Dewi Sartika, S.T.P., M.Si., selaku pembimbing kedua atas kesediaannya memberikan bimbingan, saran, kritik dan motivasi dalam proses penyelesaian tesis ini;
5. Prof. Dr. Ir. Murhadi, M.Si, selaku dosen pembahas yang telah memberikan masukan dan saran kepada penulis;
6. Bapak dan Ibu Staf Administrasi Fakultas Pertanian Universitas Lampung; 7. Teman-teman mahasiswa MTIP Angkatan 2014 Universitas Lampung yang
telah memberikan bantuan selama penelitian dan penyusunan tesis.
Penulis menyadari bahwa tesis ini banyak kekurangan, penulis berharap tesis ini dapat bermanfaat bagi semua pihak yang memerlukannya.
Bandar Lampung, Januari 2019 Penulis
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR ISI ……….. v
DAFTAR GAMBAR ……….. vi
DAFTAR TABEL ……….. vii
DAFTAR LAMPIRAN ……….. viii
I. PENDAHULUAN ……….. 1
Latar Belakang ……….. 1
Tujuan Penelitian ……….. 4
Kerangka Pemikiran ……….. 4
Hipotesis ……….. 6
II. TINJAUAN PUSTAKA ……….. 7
Salmonella spp ……….. 7
Salmonellosis ……….. 8
Diagnosa Salmonellosis ……….. 9
Pemeriksaan Serologis dengan Metode Ko-Aglutinasi ………. 10
III. BAHAN DAN METODE PENELITIAN ………... 14
Tempat dan Waktu Penelitian ……… 14
Alat dan Bahan ……….. 14
Metode ……….. 15
Pembuatan Kit Rapid Test ………... 15
Uji Kenerja Kit Rapid Test Salmonella spp ……… 20
Analisis Data ……….. 29
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ……… 30
Penyiapan Kit Ko-Aglutinasi ………... 30
Uji Kinerja Kit Ko-Aglutinasi ……….. 32
V. KESIMPULAN DAN SARAN ……… 45
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Kerangka pemikiran penelitian ………..……… 5
2. Diagram alur pembuatan kit rapid test Salmonella spp ...……….. 20
3. Diagram alur pengujian kinerjakit rapid test Salmonella spp ……… 30
4. Serum kelinci pasca pemanenan ……….…………..………... 31
5. Hasil pengujian widal tes untuk mengukur titer antibodi terhadap Salmonellaspp yang terkandung dalam serum kelinci ……….……….. 32
6. Hasil uji Serum Soft Agar (SSA) ……….……….. 33
7. Kit Ko-Aglutinasi direaksikan dengan isolat Salmonella spp ……….. 35
8. Identifikasi cemaran Salmonella spp dengan pembiakan pada Brilliant Green Agar (BGA) ………...……… 35
9. Pengujian reaksi silang ………...……….. 37
10. Hasil pengujian cemaran bertingkat dengan Kit Rapid Test Ko- aglutinasi Salmonella spp ………...………. 38
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Beberapa penelitian yang memanfaatkan reaksi ko-aglutinasi ...……….. 6 2. Kemampuan Protein A terhadap pengikatan imunoglobulin pada hewan ………… 13 3. Hasil uji Samonella sp pada TSIA dan LIA (SNI 2897 : 2008) ……….. 25 4. Reaksi biokimia Salmonella (SNI 2897 : 2008) ………..………. 29
5. Standar Mc Farland ……….. 34
6. Pengukuran Suspensi Standar 0,5 Mc Farlan Mengguna2kan Spektrofotometer
Dengan Panjang Gelombang 625 Nm ………... 38
7. Pengujian Kinerja Kit Dengan Simulasi Cemaran Bertingkat ……….. 38 8. Hasil Pengujian Sampel Daging ayam dengan Kit Ko-Aglutinasi Salmonella spp
dan kultur bakteri ……….………... 40
9. Perbandingan hasil pengujian Kit Ko-Aglutinasi dan kultur bakteri …..……….. 41 10. Hasil pengujian cemaran bertingkat dengan Kit Rapid Test Ko- aglutinasi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran Halaman
1. Foto penelitian ………...……….. 49
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang dan Masalah
Konsumsi daging ayam di Indonesia dari tahun ke tahun cenderung meningkat, sebagaimana dilaporkan oleh Ba1dan Pusat Statistik, yakni dalam tiga tahun (2012-2014) konsumsi per kapita seminggu di Tahun 2012 sebesar 0,076 kg, Tahun 2013 sebesar 0,078 kg, Tahun 2014 sebesar 0,086 kg dan di Tahun 2015 sebesar 0,103 Kg (BPS, 2017). Peningkatan konsumsi ini dimungkinkan karena harga daging ayam relatif terjangkau dibanding daging yang lain, serta kandungan gizi daging ayam yang cukup lengkap dan tinggi. Menurut Departemen Kesehatan RI (1996), kandungan gizi daging ayam per 100 g bahan adalah : kalori (g) 30,20; protein (g) 18,20; lemak (g) 25,00; kalsium (mg) 14,00;fosfor (mg) 200,00; besi (mg) 1,50;vitamin A (SI) 810,10; vitamin B1 (mg) 0,08;air (g) 55,90;berat dapat dimakan (bdd) 58,00% .
Konsumsi daging ayam bukanlah tanpa resiko yang mengancam apabila penatalaksanaan mulai dari pemeliharaan ayam sampai makanan siap dikonsumsi tidak baik, salah satunya adalah tercemar oleh mikroba. Pemerintah melalui Badan Standardisasi Nasional (BSN) telah menetapkan ambang batas cemaran mikroba, yakni Standar Nasional Indonesia (SNI) nomor 7388 Tahun 2009. Dalam standar tersebut ditetapkan kandungan maksimal mikroba dalam bahan pangan yang dapat ditolerir, akan tetapi terdapat cemaran yang mutlak harus nol, yaitu cemaran Salmonella spp, yang merupakan penyebab gangguan atau penyakit yang disebut salmonellosis.
Salmonellosis merupakan penyakit yang disebabkan oleh bakteri Salmonella spp yang dapat menyerang hewan maupun manusia atau disebut zoonosis (OIE, 2000). Salmonellosis pada manusia dikenal dua macam yakni tifoid dan non tifoid. Salmonellosis tifoid meliputi demam tifoid (thyphoid fever) yang disebabkan oleh Salmonella typhi dan demam paratifoid (parathyphoid fever) yang disebabkan oleh Salmonella paratyphi A dan B. Salmonellosis nontifoid disebabkan oleh serovar-serovar Salmonella yang tidak mempunyai hospes spesifik, yang bersifat patogen baik pada hewan maupun manusia. Penularan salmonellosis-non tifoid terjadi dari hewan ke manusia melalui makanan asal hewan yang terkontaminasi Salmonella (food-borne disease) atau penyakit berperantara makanan, contohnya: S. enteritidis (ARS, 2002; portillo, 2000).
World Health Organization (WHO) menyatakan bahwa akibat penyakit berperantara makanan cukup besar, yakni 1 dari 10 orang jatuh sakit dan 33 juta orang kehilangan hidup yang sehat setiap tahun. Kondisi tersebut bisa menjadi sangat parah, terutama bagi anak kecil. Diare adalah penyakit yang paling umum akibat makanan yang tidak aman, 550 juta orang jatuh sakit setiap tahunnya, termasuk 220 juta anak di bawah usia 5 tahun. Salmonella adalah 1 dari 4 penyebab global utama penyakit diare. Hingga saat ini, 60-80% kasus salmonellosis tidak dikenali sebagai bagian dari wabah yang sporadis atau tidak didiagnosis sama sekali (Media Centre WHO, 2016)
Cemaran mikroba dalam bahan pangan asal hewan/ternak, khususnya cemaran Salmonella spp di wilayah Lampung dilaporkan oleh Balai Veteriner Lampung dari hasil surveilans yang telah dilakukan pada Tahun 2012-2015 yang
masing-masing ditemukan kejadian positif cemaran Salmonella spp sebanyak 5, 27, 1 dan 0 dari setidaknya 800 sampel daging ayam segar. Kejadian cemaran Salmonella spp di Tahun 2015 di wilayah kerja Balai Veteriner Lampung nol, akan tetapi kejadian di wilayah lain masih tinggi, sebagaimana dilaporkan oleh Balai Pengujian Mutu dan Sertifikasi Produk Hewan (BPMSPH) dalam laporan tahunannya menyatakan bahwa hasil surveilans yang dilakukan di seluruh provinsi se-Indonesia ditemukan 192 kejadian positif cemaran Salmonella spp dari 1193 sampel yang diperiksa (BPMSPH, 2016). Adanya hasil uji positif mengharuskan semua pihak meningkatkan kepedulian dan antisipasi untuk dapat meniadakan kejadian positif cemaran Salmonella spp serta tidak adanya daging ayam tercemar mikroba yang terkonsumsi oleh masyarakat. Antisipasi tersebut diantaranya adalah monitoring disertai pengujian laboratorik untuk mendeteksi kemungkinan terjadinya cemaran.
Metode pengujian yang diaplikasikan untuk melakukan deteksi cemaran Salmonella spp saat ini adalah dengan melakukan isolasi dan identifikasi bakteri, atau lebih dikenal dengan kultur bakteri. Pengujian tersebut membutuhkan bahan, waktu (7 hari untuk hasil positif sedangkan apabila hasil negatif diperlukan waktu sekitar 3-4 hari) (Feng, 2001, Arianti dan Supar, 2006)), sarana dan personel penguji yang memiliki ketrampilan memadai. Kenyataan yang ada saat ini fasilitas yang dimiliki oleh laboratorium di berbagai daerah belum cukup untuk melakukan pengujian tersebut. Kondisi ini memerlukan sebuah terobosan untuk mengatasinya, salah satunya yaitu dibuatnya metoda uji yang sederhana, cepat dan memungkinkan untuk diaplikasikan di segala situasi dan kondisi. Pada penelitian
ini dirancang Kit Rapid Test yang memanfaatkan metoda ko-aglutinasi, yang diharapkan dapat menjadi pengujian tapis sebelum pengujian isolasi dan identifikasi. Kit Rapid Test hasil penelitian ini diharapkan akurat, karena metode ko-aglutinasi memiliki sifat alami yang spesifik untuk terjadinya ikatan antara antibodi terhadap antigen homolog (Amanu et al., 2015). Untuk menilai keakuratan atau kinerjanya dilakukan pengujian perbandingan dengan uji standar atau gold standard, yakni dibandingkan dengan pengujian isolasi dan identifikasi.
B. Tujuan Penelitain
Penelitian ini bertujuan untuk merancang perangkat diagnostik secara serologis berupa Kit Rapid Test dengan metode ko-aglutinasi, untuk mendeteksi cemaran Salmonella spp dengan pengujian sesuai dengan hasil uji standar yakni kultur.
C. Kerangka Pemikiran
Kendala dalam pelaksanaan pengujian cemaran Salmonella spp menggunakan metoda isolasi dan identifikasi atau kultur yang berpeluang tidak terdeteksinya kejadian cemaran Salmonella spp pada daging ayam segar di masyarakat memunculkan gagasan untuk membuat perangkat pengujian yang sederhana, mudah digunakan dan memiliki kualitas hasil uji yang baik (memiliki sensitifitas dan spesifisitas tinggi). Alur pemukiran pelaksanaan penelitian ini dapat digambarkan dalam diagram berikut :
Gambar 1. Kerangka pemikiran penelitian
Metode uji yang telah dibuat memanfaatkan teknik koaglutinasi yang didasari reaksi imunologi yakni ikatan spesifik Antara antigen dan antibodi.
Pengujian cemaran Salmonella spp, terkendala waktu, sarana,personel
Perlu metoda uji yang cepat, sederhana,akurat dan mudah
diaplikasikan (Kit Rapid Test)
Uji kinerja Kit Rapid Test
Tantang dengan kontrol negatif Bandingkan
dengan kultur bakteri Tantang dengan
sampel simulasi cemaran bertingkat Tantang dengan
isolat Salmonella spp
Data
Analisis
Kesimpulan :
- Tingkat kesesuaian uji dengan uji standar (gold standart)
-Minimum level detection (MLD)
- Kelayakan pemakaian Kit Rapid Test
Kit Rapid Test dapat digunakan sebagai
alat uji
Kinerja kit rapid tes diuji dengan menggunakan kit rapit tes untuk menguji isolat Salmonella sp, sampel daging hasil simulasi cemaran mikroba serta sampel yang dikoleksi dari lapangan. Hasil pengujian dibandingkan dengan uji kultur yang merupakan gold standard untuk menguji atau mendeteksi cemaran mikroba.
D. Hipotesis
Deteksi cemaran Salmonella spp dapat dilakukan dengan pemeriksaan serologis menggunakan Kit Rapid Test , dengan hasil pengujian sesuai dengan hasil pemeriksaan isolasi dan identifikasi Salmonella spp menggunakan metode kultur.
II. TINJAUAN PUSTAKA
Salmonella spp
Salmonella merupakan bakteri gram negatif berbentuk batang dengan ukuran 1 µm -3,5 µm x 0,55 µm -0,8 µm, motil (kecuali S.gallinarum dan S.pullorum), serta tidak berspora. Bakteri tumbuh pada suasana aerob dan fakultatif anaerob di suhu 15oC – 41oC dengan suhu optimal 37,5oC dan pH pertumbuhan 6-8. Bakteri akan mati pada suhu 56oC serta pada kondisi kering, sedangkan di dalam air bisa bertahan hidup selama 4 minggu dan memiliki habitat utama di saluran pencernaan hewan dan manusia (SNI, 2009).
Brenner et al., (2000) menyebutkan saat ini Genus Salmonella terdiri lebih dari 2.463 serotipe (serovar) yang ada di dunia. Dia menyatakan juga bahwa nomenklatur Salmonella sangat kompleks, dan ilmuwan menggunakan sistem yang berbeda untuk merujuk dan mengkomunikasikan genus ini. Namun, keseragaman dalam nomenklatur Salmonella diperlukan untuk komunikasi antar ilmuwan, pejabat kesehatan, dan masyarakat umum. Penggunaan saat ini sering menggabungkan beberapa sistem nomenclatural yang secara tidak konsisten membagi genus menjadi spesies, subspesies, subgenera, kelompok, subkelompok, dan serotipe (serovak) dan ini menyebabkan kebingungan dan menyimpang dari nomenklatur awal yang disusun oleh Kauffmann (1952) yang mendasarkan pada identifikasi serologik dari antigen O (somatic) dan antigen H (flagellar).
World Health Organization (WHO) merekomendasikan bahwa genus Salmonella dibagi menjadi 2 spesies yakni S.enterica dan S. bongori. Spesies
S.enterica terdiri dari 6 subspesies, yaitu I. S.enterica subsp enterica, II. S. enterica subspsalamae, IIIa. S. enterica subsp arizonae, IIIb. S. enterica subsp diarizonae, IV. S. Enterica subsp houtenae dan VI. S. enterica subspindica (OIE, 2000). Pembagian subspesies tersebut didasarkan pada perbedaan karakter/reaksi biokimiawi dan sifat-sifat genomiknya (Brenneret al., 2000). Salmonella subspesies I adalah serovar yang dapat menyebabkan penyakit pada manusia dan hewan-hewan berdarah panas (contoh: serotipe enteritidis, typhimurium, typhi, paratyphi,sendai, dublin, gallinarum/ pullorum dan abortus suis) (Brenner et al., 2000). Todar (2008) secara sederhana menyusun taksonomi Salmonella sebagai berikut :
Kingdom : Bacteria Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria Ordo : Enterobacteriales Famili : Enterobacteriaceae Genus : Salmonella
Spesies : S. spp e.g. S. enterica Salmonellosis
Salmonellosis merupakan penyakit yang disebabkan oleh bakteri Salmonella spp dan dapat menyerang hewan dan manusia atau disebut dengan zoonosis (OIE, 2000).Centers for Disease Control and Prevention (2013) menyatakan bahwa Salmonella akan menginfeksi hospes (manusia maupun hewan) setelah tertelan, masuk ke dalam perut seseorang dan membentuk koloni di usus
kecil dan usus besar. Bakteri menyerang mukosa usus dan usus besar serta berkembang biak. Bakteri bisa menyerang jaringan limfoid saluran gastrointestinal, kemudian menyebar ke aliran darah. Penyebaran melalui aliran darah bergantung pada faktor hospes dan virulensi strain Salmonella (terjadi kurang dari 5% infeksi). Infeksi masuk ke aliran darah, maka organ lain seperti hati, kantong empedu,tulang dan meninges akan terinfeksi. Masa inkubasi salmonellosis kira-kira 12-72 jam, namun bisa lebih lama. Gastroenteritis akibat infeksi Salmonella ditandai dengan onset mendadak diare (kadang berdarah), kram perut, demam, mual dan muntah (CDC, 2013).
Penyakit akibat infeksi Salmonella biasanya berlangsung 4-7 hari. Jika infeksi menyebar ke aliran darah dan organ dalam, akan terjadi peningkatan durasi serta tingkat keparahan penyakitnya dan biasanya akan mencakup tanda dan gejala yang berhubungan dengan organ yang terkena, misalnya adanya kasus artritis yang dikaitkan dengan infeksi Salmonella dalam durasi atau jangka yang lama. Sebesar 94% salmonellosis ditularkan melalui makanan khususnya makanan berasal dari hewan seperti daging sapi, daging unggas, susu, dan telur yang terkontaminasi kotoran dari hewan yang terinfeksi (CDC, 2013).
Diagnosa Salmonellosis
Diagnosa salmonellosis secara konvensional dilakukan dengan isolasi dan identifikasi Salmonella spp pada media selektif dengan pra pengayaan ( pre-enrichment), dan pengayaan (enrichment) yang dilanjutkan dengan uji biokimia dan uji serologi. Waktu yang dibutuhkan untuk melakukan pengujian ini 7 hari untuk
hasil positif sedangkan apabila hasil negatif diperlukan waktu sekitar 3-4 hari (FENG, 2001, Arianti dan Supar, 2006). Konfirmasi diagnosa laboratorium secara konvensional kurang memuaskan karena diperlukan banyak bahan media, alat, biaya dan tenaga. Akhir-akhir ini telah banyak dikembangkan beberapa metode deteksi cepat terhadap Salmonella seperti enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), plasmid DNA elektroforesis, immunodifusi, immunofluorescence, immunokromatografi, metode hibridisasi asam nukleat, polymerase chain reaction(PCR), electroimmunoassay, immunomagnetik presipitasi dan lysotyping bacteriophage (Depaula et al., 2002; Serbeniuk, 2002; Yeh et al., 2002, Arianti dan Supar, 2006).
Pemeriksaan Serologis dengan Metode Ko-aglutinasi
Uji ko-aglutinasi atau dikenal juga sebagai uji aglutinasi pasif telah dipakai dan dikembangkan sebagai uji serologis terhadap Haemophilus influenza (Drow et al.,1983), Haemophilus pleuropneumoniae (Mittal et al., 1983), Pasteurella haemolytica (Fodor et al., 1995), dan anthrax (Sumithra et al., 2014) dan sebagai rapid tes deteksi antigen Neisseria gonorrhoeae dan Haemophilus influenza serta virus hepatitis B (Yoshimizu dan Kimura, 1985). Teknik ko-aglutinasi memanfaatkan antibodi spesifik yang dipekakan oleh protein A untuk berikatan dengan antigen spesifik. Bagian Fc dari molekul Imunoglobulin G (IgG) dapat berikatan dengan protein A strain Staphylococcus aureus tanpa adanya hambatan aktifitas ikatan antigen spesifik dari IgG (Forsgreen dan Sjoquist, 1966).
dan adaptif. Protein A sebagai protein permukaan secara khusus bersifat patogenik pada Staphylococcus aureus. Protein ini mempunyai peranan penting bagi mekanisme bakteri dalam melekat (adhesi), kolonisasi, dan perusakan sel pada berbagai jaringan tubuh. Selain itu efek biologis yang ditimbulkan diantaranya reaksi hipersensitivitas diperlambat, menghambat opsonisasi dan antifagositosis (Suarsana, 2002).
Protein A dari S.aureus bereaksi atau berikatan kuat dengan struktur bagian Fc dari IgG pada manusia maupun kelinci (Tabel 2) (Forsgreen dan Sjoquist, 1966). Protein A, merupakan salah satu penyusun dinding sel bakteri, merupakan protein polipeptida yang dihasilkan S.aureus dan memiliki berat molekul 42 kDa. Lebih dari 95% strain S.aureus dapat menghasilkan protein A dalam berbagai variasi dan dapat mensekresikannya ke dalam media kultur. Beberapa S.aureus, contoh S.aureus strain Cowan I (ATCC 12598), mensekresikan sebesar 30% protein A, dan strain methicillin-resistant S.aureus (MRSA) mensekresikan semua protein A ke dalam media kultur (Forsgreen dan Sjoquist, 1969). Protein A digunakan oleh antibodi untuk penyamaran dan perlindungan. Ketika IgG spesifik ditambahkan pada protein A yang terdapat pada Staphylococcus aureus dan kemudian diikuti antigen homolog akan dihasilkan aglutinasi (Carter dan Wise, 2004).
Imunoglobulin G merupakan antibodi utama yang terdapat dalam serum hewan maupun manusia. Molekul IgG merupakan protein yang stabil dalam serum dan memiliki waktu paruh lebih dari 3 minggu. Berdasarkan reaktivitasnya, IgG diproduksi sedikit pada waktu awal respon primer, akan tetapi jumLahnya
meningkat akibat reaksi sekunder karena adanya tantangan ulang antigen yang bersifat imunogenik (Wasito dan Wuryastuti, 2014).
Tabel 2. Kemampuan Protein A terhadap pengikatan imunoglobulin pada hewan (Bjorck dan Kronvall, 1984; Harlow dan Lane, 1988).
Spesies Jenis Imunoglobulin Tingkat pengikatan
protein A
Kelinci IgG ++
Sapi IgG1
IgG2
- ++
Domba IgG1
IgG2
- ++
Kambing IgG1
IgG2
+ ++
Kuda IgG (Fab)
IgG (Fc) IgG (lisostapin)
+ + - Keterangan: ++ Mengikat kuat; + Mengikat kurang kuat; - Tidak mengikat
Penelitian yang berbasis reaksi imunologis yang memanfaatkan reaksi spesifik antigen-antibodi, khususnya reaksi aglutinasi sudah banyak dilaksanakan. Pada umumnya pemanfaatan rekasi tersebut untuk melakukan deteksi penyakit tertentu. Pemanfaatan dalam bidang kesehatan masyarakat ataupun kesehatan pangan asal hewan masih sangat jarang dilakukan terlebih di Indonesia. Beberapa penelitian yang memanfaatkan reaksi ko-aglutinasi antara lain tertera dalam tabel 1.
[image:26.595.115.510.210.416.2]
Tabel 1. Beberapa penelitian yang memanfaatkan reaksi ko-aglutinasi. No Peneliti/Tahun/Judul Persamaan Perbedaan
1
Bootland and Leong, (1992) “Staphylococcal Co-agglutination, a Rapid Method of Identifying Infectious Hematopoietic Necrosis Virus.”
Penggunaan Kit
ko-aglutinasi Deteksi Infectious Hematopoietic Necrosis Virus (IHNV)
2
Qodri et al., (1994) Development and Evaluation of Rapid Monoclonal Antibody- Based Coagglutination Test for Direct Detection of Vibrio cholerae 0139.
Penggunaan Kit ko-aglutinasi
Deteksi Vibrio cholerae
3
Saharia and Prasad, (2001) Development of Co-agglutination Kit for the Diagnosis of Pseudomonas fluorescens Infection in Fishes
Penggunaan Kit ko-aglutinasi Deteksi Pseudomonas fluorescens 4
Amanu et al., (2015) Development of Co-agglutination Method for Viral Nervous Necrosis from Grouper (Epinephelus sp.) in Batam
Penggunaan Kit ko-aglutinasi
Deteksi Viral Nervous Necrosis (VNN)
5
Hamdu, (2017) pengembangan perangkat uji serologis dibandingkan uji molekuler untuk deteksi penyakit viral nervous necrosis (vnn) pada kerapu macan (Epinephelus fuscoguttatus)
Penggunaan Kit ko-aglutinasi
Deteksi Viral Nervous Necrosis (VNN)
6
Sulistiyono, (2017) Rapid diagnostic test red sea bream Iridoviral Disease (RSIVD) pada ikan kerapu (Epinephelus Sp) dengan kit ko-aglutinasi dan studi molekuler
Penggunaan Kit ko-aglutinasi
Deteksi Iridoviral Disease pada ikan kerapi
III. BAHAN DAN METODE PENELITIAN
A. Tempat dan Waktu
Penelitian telah dilaksanakan mulai Oktober 2017 sampai Mei 2018. Seluruh proses penelitian telah dilaksanakan di laboratorium Balai Veteriner Lampung.
B. Alat dan Bahan
Alat- alat yang diperlukan dalam pelaksanaan penelitian ini adalah Dispossible syrinx (3 mL, 5 mL, 10 mL), filter dialisa 8000 Da, pipet Pasteur, waterbath, sentrifus, magnetic stirer, beker glass (50 mL, 300 mL) , tabung konikel 15 mL, object glass, tabung reaksi, cawan petri. Bahan-bahan yang digunakan adalah isolat Salmonella spp, isolat Staphylococcus aureus, larutan standar Mc Farland, kelinci percobaan (umur kurang lebih dua tahun dengan berat badan ±2 kg), amonium sulfat jenuh ( (NH4)2SO4) pH 8,0 , NaCl fisiologis 0,85%, Phosphat Buffer Saline (PBS) pH 7,2 , Formalin Buffer 0,5%, Triptone Soya Agar (TSA), Lactose broth (LB), Tetrathionate broth, Serum Soft Agar (SSA), VP-MR medium, Urea Broth, Lysin iron agar, Malonate broth, Triple Sugar Iron (TSI), Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) agar, Phenol red lactose broth, aquadestilata.
C. Metode
Penelitian ini terbagi menjadi dua kegiatan utama, yaitu pembuatan Kit Rapid Test dan uji kinerja Kit Rapid Test.
a. Pembuatan Kit Rapid Test
Pembuatan Kit Rapid Test terbagi menjadi 4 (empat) sub kegiatan, yakni penyiapan serum anti, isolasi imunoglobulin dari serum anti, penyiapan proteinA Staphylococcus aureus, pengikatan (couple) imunoglobulin dengan Protein A. Teknik pelaksanaan mengacu pada Kimura (1985) dan Amanu (2015).
a.1 Penyiapan antiserum
Langkah kerja penyiapan antiserum adalah sebagai berikut :
1. Isolat Salmonella spp berkonsentrasi 1,2x109 (Mc Farlan 4) yang telah dilemahkan diinokulasikan ke kelinci percobaan yang telah disiapkan melalui rute intraperitonial dengan dosis berturut-turut setiap minggunya adalah 0,5 mL, 1 mL, 2 mL dan 3 mL.
2. Serum dipanen pada minggu ke lima, dengan pengambilan darah sebanyak 10 mL melalui vena auricularis, setelah dipastikan bahwa produksi antibodi berjalan baik (dengan uji widal).
3. Titer antibodi diukur dengan metode widal dilakukan pada minggu ke-5 dengan metode widal. Pertama, disiapkan 2 baris tempat yang masing masing berisi 12 tabung atau menggunakan plat yang memiliki sumuran 12 x 8 . 4. NaCl fisiologis sebanyak 1,8 mL diisikan ke dalam sumuran pertama diisi,
sumuran ke 2 sampai ke 12 diisi NaCl fisiologis masing masing 1 mL. Sumuran pertama ditambahkan serum anti dari kelinci yang akan diuji sebanyak 0,2 mL,
kemudian dicampur homogen dengan mikropipet dan dihindari munculnya gelembung udara. Selanjutnya sebanyak 1 mL dari sumuran 1 dipindahkan ke sumuran 2 dengan pipet steril dan dicampur hingga homogen. Sebanyak 1 mL suspensi dari sumuran 2 dipindahkan ke sumuran 3, dilakukan hal yang sama hingga sumuran ke 11. Sisa 1 mL dari sumuran ke 11 kemudian dibuang. 5. Antigen sebanyak 1 mL ditambahkan ke dalam tiap sumuran dari 1 sampai 12
dengan konsentrasi 5 x 108 sel/mL standart Mc Farland dicampur homogen dengan menggoyangkan (shaking) rak sebanyak 3-4 kali. Rak ditempatkan pada waterbath suhu 37oC selama 18 jam.
6. Titer antibodi dibaca berdasarkan hasil aglutinasi yang terjadi pada masing masing sumuran dilakukan dengan hati hati. Titer antibodi masing masing sumuran tersebut; sumuran 1(10), 2(20), 3(40), 4(80), 5(160), 6(320), 7(640), 8(1280), 9(2560), 10(5120), 11(10240). AAntibodi standar memiliki syarat minimal titer antibodi lebih dari 640, dan panen antibodi dilakukan jika titernya lebih dari 640 (Garvey et al., 1977).
7. Antibodi titer kurang dari 640 maka dilakukan penyuntikan kembali dengan dosis 3 mL. Darah diambil pada minggu ke-5 dengan spuit melalui vena auricularis di telinga sebanyak 12 mL dari masing-masing kelinci untuk mendapatkan serum kurang lebih 7-8 mL. Serum terbentuk setelah satu jam pengambilan darah dan disentrifugasi untuk mendapatkan jumLah serum yang maksimal.
8. Serum dipisahkan dari endapan/bekuan sel darah merah setelah satu jam, kemudian dilanjutkan dengan disentrifugasi untuk mendapatkan jumLah serta kualitas serum yang maksimal.
9. Serum yang didapat kemudian diinaktifasi dengan perlakuan pemanasan 56oC selama 30 menit.
10. Serum disimpan di dalam refrigerator dengan suhu 4oC sebelum dilakukan isolasi imunoglobulin untuk menghindari kontaminasi dan kerusakan antibodi. a.2 Isolasi imunoglobulin dari antiserum
Isolasi imunoglobulin dimulai dengan presipitasi serum, dengan langkah kerja sebagai berikut :
1. Serum yang didapatkan masing-masing sekitar 7,5 mL diberi kode, selanjutnya ditambahkan amonium sulfat jenuh ke dalam serum dengan volume yang sama dengan serum (1:1), sedikit demi sedikit sambil dicampur menggunakan magnetic stirrer selama 30-60 menit untuk memisahkan antibodi spesifik dalam serum.
2. Suspensi serum kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm selama 30 menit atau 10.000 rpm selama 15 menit.
3. Supernatan dibuang, pellet diresuspensi dengan NaCl fisiologis (0,85% NaCl) sampai volume campuran seperti semula dan dipresipitasi kembali dengan amonium sulfat. Proses ini diulang hingga 3 kali agar antibodi spesifik terpisah dengan baik.
Tahapan berikutnya adalah dialisis serum, dengan langkah kerja sebagai berikut : 1. Pellet serum hasil presipitasi diresuspensi dengan NaCl fisologis 0,85%.
Selanjutnya suspensi didialisis menggunakan membran dialysa 8000 dalton dalam PBS dengan pH 7.2 selama 12 jam. Setelah 12 jam resuspensi lagi dengan PBS ber-pH 7.2 yang baru dan selanjutnya dialisis diulang lagi sampai tiga (3) kali.
2. Imunoglobulin dihasilkan pada akhir dialisis. a.3 Penyiapan Protein A Staphylococcus aureus Langkah kerja yang dilaksanakan adalah sebagai berikut :
1. Isolat murni umur 24 jam S. aureus dipupuk pada media TSA untuk memperbanyak, inkubasi 37°C selama 24-48 jam. Setelah isolat Staphylococcus aureus dipanen dari TSA, selanjutnya disuspensikan dalam PBS pH 7,2 dan dikumpulkan dalam tabung konikel 15 mL.
2. Suspensi bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit dan dicuci kembali dengan PBS (pH 7.2) 3-5 kali.
3. Supernatan kemudian dibuang, pellet bakteri ditambah larutan formalin buffer 0,5% dan didiamkan selama semalam pada suhu kamar.
4. Suspensi selanjutnya diinaktifasi dengan dipanaskan pada suhu 80oC selama 15-60 menit, lalu didinginkan cepat di lemari es. Kemudian suspensi disentrifugasi 3000 rpm selama 15 menit dan dicuci tiga kali dengan PBS. 5. Supernatan dibuang dan diambil pelletnya untuk dibuat suspensi protein A S.
aureus 10% dengan PBS dan siap digunakan.
a.4 Pengikatan (Couple) Imunoglobulin G (IgG) dan Protein A Langkah kerja yang dilaksanakan adalah sebagai berikut :
1. Suspensi protein A S.aureus dimasukkan dalam tabung reaksi atau tabung konikel kapasitas 15 mL, selanjutnya ditambahkan imunoglobulin untuk diikatkan (coupling) dengan volume yang sama dengan volume suspensi protein A Staphylo cossuc aureus atau perbandingan 1:1, kemudian didiamkan selama 1 (satu) malam pada suhu 25oC atau suhu kamar.
2. Suspensi yang telah tercampur rata selanjutnya disentrifugasi 1500 rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang kemudian pellet diresuspensi atau ditambahkan PBS sampai volume awal. Resuspensi dilakukan hingga tiga kali dan suspensi akhir digunakan sebagai Kit.
3. Zat pewarna giemsa (biru) atau fuchsine (merah) ditambahkan dalam kit sebesar 0,1 % guna mempermudah pengamatan.
Secara ringkas alur kerja pembuatan Kit Rapid Test Salmonella spp adalah sebagai berikut :
Gambar 2. Diagram alur pembuatan Kit Rapid Test Salmonella spp
b. Uji kinerja Kit Rapid Test Salmonella spp Tahapan pengujian kinerja kit sebagai berikut :
b.1 Pengujian menggunakan isolat Salmonella spp, denganlangkah kerja sebagai berikut :
1. Suspensi bakteri Salmonella spp sebanyak 0,5 mL diteteskan ke permukaan slide glass.
2. Kit Rapid Test Salmonella spp ditambahkan dengan volume yang sama dengan volume suspensi bakteri.
3. Hasil positif ditunjukkan dengan terjadinya aglutinasi (adanya debris pasir) Antiserum
b.2 Pengujian dengan menggunakan sampel hasil simulasi cemaran mikroba (Salmonella spp), denganlangkah kerja sebagai berikut :
1. Uji pendahuluan untuk menentukan konsentrasi Salmonella spp dengan melakukan uji Angka Lempeng Total (ALT) terhadap isolat.
2. Konsentrasi bertingkat Salmonella spp, yakni konsentrasi 101, 102,103, 104 dan 105 (x 1,5) disiapkan dalam Lactose Broth (LB). Penentuan konsentrasi didasarkan pada pengukuran menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 625 nm. Mc Farland 0,5 (konsentrasi standar) akan terbaca nilai adsorbansi 0,08-0,1. Selanjutnya dilakukan pengencran bertingkat untuk mendapatkan konsentrasi yang dibutuhkan.
3. Tiga potong daging ayam @ 25 g dimasukkan/direndam dalam 225 mL NaCl fisiologis yang didalamnya mengandung 1% (v/v) suspensi isolat bertingkat tersebut, selama 1 jam. Setelah 1 jam daging dikeluarkan dari rendaman, kemudian daging dimasukkan ke dalam plastik steril dan dibiarkan dalam suhu kamar selama 1 jam.
4. Daging dicincang kemudian dipisah atau dibagi menjadi dua, 1 bagian dimasukkan ke dalam 50 mL LB dengan wadah tab corning yang selanjutnya akan diisolasi dan diidentifikasi cemaran bakterinya sebagai uji pembanding, 1 bagian lainnya dibuat suspensi dalam PBS pH 7,2 dengan volume 50 mL sebagai bahan uji tantang Kit Rapid Test Salmonella spp.
5. Perlakuan lanjutan terhadap bahan uji tantang Kit Rapid Test Salmonella spp : a. Suspensi dipanaskan 100°C selama 30 menit., kemudian suspensi disentrifuge
dengan kecepatan 4000-6000 rpm, selama 30 menit.
b. Supernatan sebanyak 0,5 mL diteteskan ke permukaan slide glass. c. Kit Rapid Test Salmonella spp ditambahkan dengan volume yang sama. d. Hasil positif pengujian menggunakan Kit Rapid Test Salmonella spp
ditunjukkan dengan terjadinya aglutinasi (adanya debris pasir).
b.3 Pengujian menggunakan sampel lapangan, dengan langkah kerja sebagai berikut :
1. Satu gram potongan daging ayam dicincang, kemudian dimasukkan ke dalam tabung, selanjutnya 9 mL PBS atau NaCl fisiologis ditambahkan kedalam tabung (buat suspensi).
2. Suspensi dipanaskan 100°C selama 30 menit, kemudian suspensi disentrifus dengan kecepatan 4000-6000 rpm, selama 30 menit.
3. Supernatan sebanyak 50 µl diteteskan ke permukaan slide glass.
4. Kit Rapid Test Salmonella spp ditambahkan dengan volume yang sama.
c. Membandingkan dengan uji standar (kultur bakteri).
Pelaksanaan pengujian mengikuti SNI 2897 : 2008 dengan beberapa modifikasi (inhouse modification yang telah dipertanggung jawabkan kepada Komite Akreditasi Nasional).Langkah kerja yang dilaksanakan adalah sebagai berikut : c.1 Pra-pengayaan
Sampel uji biasanya mengandung Salmonella dalam konsentrasi rendah, sehingga diperlukan langkah-langkah untuk memperbanyak, yakni dengan memindahkan suspensi (dari 2.2 langkah ke-5) ke dalam Erlenmeyer atau wadah steril, kemudian diinkubasikan pada temperatur 35 ºC selama 24 jam ± 2 jam.
c.2 Pengayaan
Untuk memperbanyak konsentrasi Salmonella dilakukan juga penghambatan tumbuhnya bakteri lain dengan langkah-langkah sebagai berikut :
1. Biakan pra-pengayaan diaduk perlahan kemudian diambil dan dipindahkan masing-masing 1 mL ke dalam media 10 mL TTB, sedangkan untuk media RV0,1 mL ke dalam 10 mL RV.
2. Media RV diinkubasi pada temperatur 42 ºC ± 0.2 ºC selama 24 jam ± 2 jam. Sedangkan untuk media TTB diinkubasi pada temperatur 35 ºC ± 2 ºC selama 24 jam ± 2 jam.
c.3 Isolasi dan identifikasi
Langkah kerja yang dilaksanakan adalah sebagai berikut :
1. Dua atau lebih koloni diambil dengan jarum ose dari masing-masing media pengayaan yang telah diinkubasikan, dan inokulasikan pada media HE, XLD dan BSA, kemudian diinkubasi pada temperatur 35 ºC selama 24 jam ± 2 jam. Untuk BSA apabila belum jelas dapat dinkubasi lagi selama 24 jam ± 2 jam. 2. Koloni Salmonella diamati pada media HE terlihat berwarna hijau kebiruan
dengan atau tanpa titik hitam (H2S). Pada media XLD koloni terlihat merah muda dengan atau tanpa titik mengkilat atau terlihat hampir seluruh koloni hitam. Pada media BSA koloni terlihat keabu-abuan atau kehitaman, kadang metalik, media di sekitar koloni berwarna coklat dan semakin lama waktu inkubasi akan berubah menjadi hitam.
3. Identifikasi dilakukan dengan mengambil koloni yang diduga dari ketiga media tersebut, selanjutnya diinokulasikan ke TSIA dan LIA dengan cara menusuk ke dasar media agar, selanjutnya digores pada media agar miring. 4. Biakan diinkubasi pada temperatur 35 ºC selama 24 jam ± 2 jam, kemudian
[image:38.595.131.530.320.394.2]diamati koloni spesifik Salmonella spp dengan hasil reaksi seperti tercantum pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil uji Samonella sp pada TSIA dan LIA (SNI 2897 : 2008)
Media Agar miring (Slant)
dasar Agar
(Buttom) H2S
Gas
TSIA Alkalin / K (merah) Asam / A (kuning) Positif (hitam) Negatif/positif
LIA Alkalin / K (ungu) Alkalin / K (ungu) Positif (hitam) Negatif/Positif
c.4 Uji biokimia
Uji biokimia yang dilaksanakan adalah sebagai berikut : a. Uji indole
Pelaksanaan uji indole adalah dengan menginokulasikan koloni dari media TSIA ke TB, selanjutnya diinkubasi pada temperatur 35 ºC selama 24 jam ± 2 jam. Selanjutnya Reagen Kovacs ditambahkan 0,2 mL sampai dengan 0,3 mL. Hasil uji positif ditandai dengan adanya cincin merah dipermukaan media. Hasil uji negatif ditandai dengan terbentuknya cincin kuning. Hasil uji spesifik Salmonella adalah negatif uji indole.
b. Uji Voges-Proskauer (VP)
MR-VP dan diinkubasi pada temperatur 35 ºC selama 48 jam ± 2 jam. Selanjutnya MR-VP sebanyak 5 mL dipindah ke dalam tabung reaksi dan tambahkan 0.6 mL larutan α-naphthol serta 0.2 mL KOH 40 %, kemudian digoyang-goyang sampai tercampur dan didiamkan. Reaksi dapat dipercepat dengan menambahkan kristal kreatin. Pembacaan hasil setelah 4 jam. Hasil uji positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna pink sampai merah delima. Umumnya Salmonella memberikan hasil negatif untuk uji VP (tidak terjadi perubahan warna pada media).
c. Uji Methyl Red (MR)
Pelaksanaan uji Methyl Red (MR) adalah dengan mengambil biakan dari media TSIA menggunakan ose, kemudian diinokulasikan ke dalam tabung yang berisi 10 mL media MR-VP dan diinkubasi pada temperatur 35 ºC selama 48 jam ± 2 jam. Selanjutnya indikator Methyl Red sebanyak 5 tetes sampai dengan 6 tetes ditambahkan pada tabung. Hasil uji positif ditandai dengan adanya difusi warna merah ke dalam media. Hasil uji negatif ditandai dengan terjadinya warna kuning pada media. Umumnya Salmonella memberikan hasil positif untuk uji MR.
d. Uji citrate
Pelaksanaan uji citrate adalah dengan menginokulasikan koloni dari TSIAd ke dalam SCA menggunakan ose, kemudian diinkubasi pada temperatur 35 ºC selama 96 jam ± 2 jam. Hasil uji positif ditandai adanya pertumbuhan koloni yang diikuti perubahan warna dari hijau menjadi biru. Hasil uji negatif ditandai dengan tidak adanya pertumbuhan koloni atau tumbuh sangat sedikit dan tidak terjadi perubahan warna. Umumnya Salmonella memberikan hasil positif pada uji citrate.
e. Uji serologis
Uji serologis dilaksanakan terhadap polyvalent somatic (O) dan polyvalent flagelar (H) dengan langkah kerja sebagai berikut :
e.1 Uji polyvalent somatic (O)
Pengujian serologis pertama yang dilakukan untuk deteksi antigen salmonella dilakukan dengan langkah-langkah berikut :
1. Satu ose koloni dari TSIA atau LIA diletakkan pada gelas preparat dan ditambahkan satu tetes larutan garam fisiologis (NaCl 0,85 %) steril kemudian diratakan.
2. Satu tetes Salmonella polyvalent somatic (O) antiserum diteteskan disamping suspensi koloni.
3. Suspensi koloni dicampur ke antiserum sampai tercampur sempurna.
4. Campuran tersebut dimiringkan ke kiri dan ke kanan dengan latar belakang gelap sambil diamati adanya reaksi aglutinasi.
5. Kontrol disiapkan dengan mencampur larutan garam fisiologis dan antiserum. e.2 Uji polyvalent flagelar (H)
Uji serologi untuk mendeteksi antigen flagelar Salmonella dilakukan dengan langkah-langkah :
1. Koloni dari TSIA yang hasil uji urease negatif diinokulasi ke dalam BHIB dan diinkubasi pada temperatur 35 ºC selama 4 jam sampai dengan 6 jam atau ke dalam TSTB dan inkubasi pada temperatur 35 ºC selama 24 jam ± 2 jam.
2. Larutan garam fisiologis berformalin (formalinized physiological saline)sebanyak 2,5 mLditambahkan kedalam 5 mL dari salah satu kultur di atas.
3. Larutan Salmonella Polyvalent flagellar (H) antisera sebanyak 0,5 mL dimasukkan kedalam tabung serologi ukuran 10x75 mm.
4. Antigen yang akan di ujisebanyak 0,5 mL ditambahkan .
5. Larutan garam fisiologis kontrol disiapkan dengan mencampurkan 0,5 mL larutan garam fisiologis berformalin dengan 0,5 mL antigen berformalin (formalinized antigen).
6. Kedua campuran tersebut diinkubasikan dalam penangas air pada temperatur 48 ºC sampai dengan 50 ºC.
7. Penggumpalan selanjutnya dapat diamati setiap 15 menit selama 1 jam. 8. Hasil uji positif ditandai dengan adanya penggumpalan, sedangkan pada
kontrol tidak terjadi penggumpalan. Interpretasi hasil Salmonella spp.
[image:41.595.119.518.581.744.2]Interpretasi hasil uji biokimia Salmonella spp. dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4. Reaksi biokimia Salmonella (SNI 2897 : 2008)
No Uji substrat Hasil reaksi
Positif Negatif Salmonella
1 Glukosa (TSI) Tusukan kuning Tusukan merah +
2 Lysine
Dekarboksilase(LIA) Tusukan ungu
Tusukan kuning +
3 H2S (TSI dan LIA) Hitam Tidak hitam +
4 Uji indol Permukaan warna
merah
Permukaan warna
kuning -
5 Uji Polyvalent
flagelar Aglutinasi
Tidak aglutinasi
+
6 Uji Polyvalent
Somatic Aglutinasi
No Uji substrat Hasil reaksi
Positif Negatif Salmonella
8 Uji Methyl Red Merah menyebar Warna kuning
menyebar +
9 Simmon’s sitrat Pertumbuhan
warna biru
Tidak ada per-tumbuhan dan tidak ada perubahan
V
Pengujian Kinerja Kit Rapid Test
[image:42.595.64.567.319.698.2]Pelaksanaan pengujian kinerja Kit Rapid Test Salmonella spp sebagaimana tergambarkan pada gambar 3.
Gambar 3. Diagram alur pengujian kinerjaKit Rapid Test Salmonella spp
Uji Kinerja Kit Rapid Tes
Isolat >< Kit rapidtest (isolat dengan konsentrasi bertingkan)
Hasil (+) : bentukan debris Hasil (-) : tidak terjadi bentukan debris
Simulasi cemaran Salmonella
spp pada daging ayam segar dengan konsentrasi bertingkat (101, 102, 103, 104,105)
Sampel >< Kit Rapid Test
Hasil (+) : bentukan debris Hasil (-) : tidak terjadi bentukan debris
Kultur bakteri
(Salmonella spp)
Hasil (+) : Salmonella spp tubuh Hasil (-) : Salmonella spp tidak tumbuh
debris
Dibandingkan
Kontrol (-) >< Kit Rapid Test
Hasil (+) : bentukan debris Hasil (-) : tidak terjadi bentukan debris
Pengujian kinerja dengan jalan membandingkan hasil uji Kit Rapid Test Salmonella spp terhadap sampel-sampel lapangan dengan uji standar (isolasi dan identifikasi) yang dilakukan pengulangan sebanyak lima kali untuk masing-masing tingkatan cemaran. Pengulangan dilakukan untuk meningkatkan validitas hasil pengujian.. Pembandingan hasil pengujian bertujuan untuk mendapatkan nilai sensitifitas dan spesifisitas dari Kit Rapid Test Salmonella yang merupakan uji baru.
D. Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisa secara deskriptif. Hasil analisa memberikan informasi tingkat kesesuaian antara hasil uji ko-agulasi dan hasil isolasi-identifikasi menggunakan metode kultur bakteri, nilai sensitifitas dan spesifisitas uji ko-agulasi serta konsentrsi cemaran terendah yang mampu diuji dengan kit ko-aglutinasisi.
V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Setelah melakukan seluruh rangkaian penelitian, diperoleh kesimpulan sebagai berikut :
1. Kit uji cepat rapid test Ko-Aglutinasi Salmonella berhasil dibuat dan memiliki sensitifitas 100 % serta spesifisitas 93,75%.
2. Konsentrasi bakteri minimal yang bisa terdeteksi oleh kit uji cepat sebesar 1,5 x 103.
3. Ditemukan cemaran Salmonella sp pada sampel daging ayam yang dikoleksi dari lapangan.
B. Saran
Upaya-upaya yang bisa dilakukan untuk memperkuat keberadaan pengujian menggunakan Kit Rapid Test Salmonella dan untuk memberikan kontribusi yang lebih baik kepada masyarakat, disarankan beberapa hal sebagai berikut :
1. Kit Rapid Test Salmonella spp direkomendasikan sebagai uji terakreditasi di laboratorium.
2. Perlu penelitian lebih lanjut mengenai pengujian cemaran daging lainya dengan kit uji cepat rapid test Ko-Aglutinasi.
DAFTAR PUSTAKA
Agricultural Research Service (ARS), 2002. A Focus on Salmonella. http://www.nal.usda. gov/fsirio/research/fsleets/fsheet10.htm.
Ahmed, O.B., Atif, H.A., Ibrahim, H.A., El-Rahim, A. and Hegazy, A.I., 2014. Detection of Salmonella in Food Samples by Culture and Polymerase Chain Reaction Methods. Department of Environmental and Health Research, The Custodian of the Two Holy Mosques Institute for Hajj and Omraa, Kingdom of Saudi Arabia. Journal of Bacteriology & Parasitology, 5:1-3
Amanu, S., Rifai, A.B., Syarif, A. dan Fikar, M., 2015. Development of Co-agglutination Method for Viral Nervous Necrosis from Grouper (Epinephelus sp.) in Batam. JAST B, 5:502-505
Anonim, 2017. encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm.
Ariyanti, T., Supar, 2006. Problematika Salmonellosis Pada Manusia. Balai Penelitian Veteriner. Lokakarya Nasional Penyakit Zoonosis. Bogor. P : 161-171
Balai Pengujian Mutu dan Sertifikasi Pangan Asal Hewan (BPMSPH), 2016. LaporanTahunan 2015. Bogor
Bjorck, L. dan Kronvall, G., 1984. Purification and some properties of Streptococcal protein G, a novel IgG-binding reagent. J. Immunology. 133(2):969-974.
Brenner F.W., Villar R., Tauxe R., Swaminathan B., 2000. Salmonella Nomenclature. National Center for Biotechnology Information (NCBI), Maryland. 7 : 2465-2467
Carter, G.R. dan Wise, D.J. 2004. Essential of bacteriology and mycology. 6th. Ed, Iowa State Press, USA. P:193-195.
Centers for Disease Control and Prevention (CDC), 2013. Infection with Salmonella. National Public Health Institute of the United States
.
Cowan dan Steel’s. 1993. Manual for The Identification of Medical Bacteria, 3th Ed. Cambridge University Press. P:140.
Drow, D.L., Manning, D.D. 1983. Comparison of Coagglutination, Latex Agglutination, and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Detection of Haemophilus influenza Type B Infection. Diagnose Microbiol Infect Dis. 1: 317-322
Englard, S., Seifter, S., 1990. Precipitation Techniques. Methods in Enzymology. 182 : 285–300.
Fodor, L., Penzes, Z., Varga, J. 1995. Coagglutination Test for Serotyping Pasteurella haemolytica. Journal of Clinical Microbiology. P : 393 – 397 Forsgreen, A., dan Sjoquist, J., 1966. Protein A from Staphylococcus aureus.
Pseudoimune reaction with human globulin. J.immunology. 97 : 822-827. Garvey, J.S., Cremer, N.E., Sussdorf, D.H.1977. Methods ini Immunology 3rd
Edition. A Laboratory text for Instruction and Research.W.A. Benjamin Inc. Massachusetts. P : 545
Grodzki, A.C., dan Berenstein, E., 2009. Antibody Purification: Ammonium Sulfate Fractionation or Gel Filtration, in: Immunocytochemical Methods and Protocols. Humana Press. 3th edition. 588 : 15-26.
Harlow, E. dan Lane, D., 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. P : 616-619.
Kauffmann F, Edwards P R., 1955. Classification and nomenclature of Enterobacteriaceae. Int Bull Bacteriol Nomencl Taxon. 2 : 2–8.
Office International Des Epizootis (OIE)., 2000. Salmonellosis. In Manual Of Standards Fordiagnostic Test And Vaccines. World organization for animal health, P : 691-699.
Portillo, F. G., 2000. Molecular and Cellular Biology of Salmonella Pathogenesis In Microbial Foodborne Disease: Mechanisms of Pathogenesis and Toxin Synthesis First Edition. Lancester,Pennysylvania 17604 USA, P : 3-7. Standar Nasional Indonesia (SNI) 2897, 2008. Metode Pengujian Cemaran
Mikroba Dalam Daging, Telur dan Susu serta Hasil Olahannya. Badan Standarisasi Nasional. Jakarta.
Standar Nasional Indonesia (SNI) 7388, 2009. Batas Maksimal Cemaran Mikroba Dalam Pangan. Badan Standarisasi Nasional. Jakarta.
Suarsana, N.I., 2002. Protein A: Peranannya Dalam Mekanisme Infeksi. J. Vet. 3(1):37-43.
Sumithra, T.G., Chaturvedi, V.K., Gupta, P.K., Siju, S.J., Susan, C., Bincy, J., Laxmi, U., Sunita., S.C., Rai, A.K., 2014. Development of a simple method for the rapid identification of organisms causing anthrax by coagglutination test. Biologicals. 42 : 316 - 321.
Tizard, I.,1987. Veterinary Immunology. Saunders Company, Phyladelphia, Third Edition
Todar K.,2008. Salmonellaand Salmonellosis. On Line Textbook of Bacteriology Wasito, R. dan Wuryastuti, H. 2014. Antibodi dan Imunohistokimia. Yogyakarta:
Rapha Publishing.
World Health Organization (WHO) Media Centre, 2017. Salmonella (non-typoidal). www.who.int
Yoshimizu, M., dan Kimura, T., 1985. A Coagglutination Test with Antibody-Sensitized Staphylococci for Rapid and Simple Diagnosis of Bacterial and Viral Diseases of Fish. Fish Pathology. 20 : 243-261.
