The effect of ATP-dependent K(+)-channel opener on transmembrane potassium exchange and reactive oxygen species production upon the opening of mitochondrial pore

УДК 577.23

ВлияниЕ аКтиВатора атр-заВисимого

K

-Канала на трансмЕмбранный обмЕн Калия

и образоВаниЕ аКтиВных форм Кислорода В услоВиях

отКрыВания митохондриальной поры

И. н. МАнькОВскАя, В. Ф. сАгАч

Институт физиологии им. А. А. Богомольца нАн украины, киев; e-mail: [email protected]

Изучено влияние диазоксида (DZ) – активатора митохондриального АТр-зависимого K+-канала (K+

ATP-канала) на трансмембранный обмен K

+ в митохондриях печени крыс и образование активных форм кислорода (АФк) в условиях открывания митохондриальной поры (mitochondrial permeability transition pore, MPTP). установлено, что под действием DZ происходит активация K+-цикла (входа K+ и K+/н+-обмена) с максимальным эффектом в области ≤500 нМ DZ. показано, что открывание МрТр приводит также к активации K+-цикла при одновременной активации циклического транспор -та са2+. В отсутствие деполяризации са2+-цикл поддерживается работой МрТр и са2+-унипортера. Активация K+-цикла при открывании МрТр обусловлена стимуляцией K+/н+-обмена, однако дальней -шее ускорение K+/н+-обмена под действием DZ приводит к ингибированию МрТр. показано также, что DZ снижает скорость образования АФк при открывании МрТр в митохондриях печени. сделан вывод, что уменьшение продукции АФк, как и активация K+/н+-обмена, являются составляющими комплексного механизма ингибирования МрТр под действием активатора K+

ATP-канала.

к л ю ч е в ы е с л о в а: митохондриальная пора, K+

ATP-канал, K

+/н+-обмен, са2+-цикл, активные формы кислорода, митохондрии печени крыс.

И

-тов потенциалзависимого транспорта K+ началось в 60-ые годы прошлого столе

-тия. Однако в работах 60–80-ых годов изучение потенциалзависимого транспорта K+ представ -ляло скорее теоретический интерес, поскольку считали, что эндогенная система потенциалза

-висимого входа K+ в митохондриях отсутству -ет. Открытие АТР-зависимого K+-канала (K+

ATP

-канала) [1] и выявление кардиопротекторных эффектов его фармакологических активаторов (диазоксида, пинацидила, никорандила и др.) [2, 3] вызвало интерес самых широких кругов исследователей, изучающих транспорт калия и его влияние на митохондриальные функции.

Известно, что в митохондриях присутству

-ет система трансмембранного обмена K+, вклю -чающая потенциалзависимый вход K+ через

K+-каналы [4] и электронейтральный выход K+ через K+/Н+-обменник, которые вместе образуют митохондриальный K+-цикл [5]. АТР-зависимый вход K+ через K+

ATP-канал составляет значитель -ную долю транспорта K+ в митохондриях, и его физиологическая значимость в настоящее время не вызывает сомнений. Исследования послед

-него времени, в том числе и наши собственные, показали, что АТР-зависимый транспорт K+ яв -ляется физиологически важным модулятором митохондриальных функций и энергозависи

-мых процессов в митохондриях: дыхания [6–8], митохондриального объема [5], циклического транспорта K+ [8], транспорта Са2+ [9], синтеза АТР [7, 10, 11] и продукции активных форм кис

-лорода (АФК) [12, 13]. Активаторы K+

и их действие близко к феномену ишемической адаптации (preconditioning) [2, 3, 14]. Полагают, что и механизм ишемической адаптации вклю

-чает активацию K+

ATP-канала [14, 15]. По мнению исследователей, защитное действие активато

-ров K+

ATP-канала направлено на подавление ак -тивности митохондриальной циклоспоринчув

-ствительной поры (mitochondrial permeability transition pore, MPTP), открывание которой ве

-дет к индукции апоптоза и некроза клеток [16]. Предполагаемый комплексный защитный меха

-низм включает ограничение входа Са2+ [9], регу -ляцию митохондриального объема [5] и продук

-ции АФК [12, 13]. Однако роль каждого из этих эффектов в ингибировании МРТР под действи

-ем активаторов K+

ATP-канала всё ещё не вполне доказана.

Известно, что АФК являются триггерами открывания МРТР и могут многократно усили

-вать ее активность по механизму положитель

-ной обрат-ной связи, ROS-induced ROS release [17]. В то же время, опубликованные в литерату

-ре данные не дают однозначного п-редставления о роли АТР-зависимого входа K+ в регуляции ми -тохондриальной продукции АФК. К настоящему времени показано как снижение [12, 18], так и повышение продукции АФК [13] под действием фармакологических активаторов K+

ATP-канала. Соответственно, предлагаются и возможные ме

-ханизмы цитопротекторных эффектов активато

-ров K+

ATP-канала, которые в качестве централь -ного звена включают подавление МРТР. Так, по мнению авторов работ [12, 18], механизм защиты клеток от апоптоза под действием активаторов K+

ATP-канала непосредственно обусловлен сни -жением образования АФК в митохондриях, в ре

-зультате чего происходит ингибирование МРТР и предотвращение апоптоза кардиомиоцитов. Однако, по мнению Гарлида, в работах которого показано повышение продукции АФК при акти

-вации K+

ATP-канала митохондрий сердца, кардио-протекторный эффект активаторов обу словлен активацией митохондриальной протеинкина

-зы С пероксидом водорода, образующимся в матриксе вследствие входа K+, фосфорилирова -нием анионного канала VDAC и блокирова-нием МРТР [15].

Во многих работах уменьшение продукции АФК под действием активаторов K+

ATP-канала объясняют «мягким разобщением» дыхатель

-ной цепи вследствие активации K+-цикла мито -хондрий, по аналогии с «мягким» протонофор

-ным разобщением дыхательной цепи, которое снижает продукцию АФК в митохондриях [19]. Однако авторы цитируемых работ не приводят данных в подтверждение того, что снижение продукции АФК как-либо связано с K+-циклом митохондрий. Кроме того, отмечают целый ряд побочных эффектов диазоксида, не обусловлен

-ных активацией K+

ATP-канала. В частности, в на -ших работах показано неспецифическое повы

-шение входа K+ под действием диазоксида [8, 11]. Известно также, что диазоксид может подавлять дыхание митохондрий [20] и в высоких концен

-трациях обладает протонофорными свойствами [6].

Ранее мы показали, что диазоксид активи

-рует митохондриальный K+_/H+-обмен [8,21] и ак -тивация K+_/H+-обмена сопровождается ингиби -рованием МРТР [11, 21]. Поскольку активность МРТР зависит также и от продукции АФК, це

-лью настоящей работы было продолжить иссле

-дование влияния диазоксида на трансмембран

-ный обмен K+ в митохондриях печени и изучить влияние этого активатора K+

ATP-канала на обра -зование АФК в условиях открывания митохон

-дриальной поры.

материалы и методы

В опытах использовали белых крыс линии Вистар с массой тела 200–250 г. Печень про

-мывали охлажденным 0,9%-ым раствором KCl (4 °С), измельчали и гомогенизировали в 5-крат

-ном объеме среды: 250 мМ сахарозы, 20 мМ трис-НCl буфера, 1 мМ ЭДТА (рН 7,4). Для вы

-деления митохондрий гомогенат центрифугиро

-вали 7 мин при 700 g (4 °С); затем супернатант центрифугировали 15 мин при 11 000 g (4 °С). Осадок суспендировали в небольшом объеме среды без добавления ЭДТА и хранили на льду при 4 °С. Содержание протеина определяли ме

-тодом Лоури.

Светопоглощение регистрировали при 520 нм, начиная с внесения митохондрий в среду инкубации (120 мМ KCl, 2 мМ трис-НCl-буфера (рН 7,4), 5 мМ глутамата Na, 1 мМ KH₂PO₄; ко

-нечная концентрация протеина 0,3 мг/мл). Изменение концентрации добавленно

Мембранный потенциал регистрировали спектрофотометрически [22] при λ 510 и 525 нм в присутствии 10 мкМ сафранина в среде инку

-бации. Амплитуду изменения поглощения выра

-жали в % от контроля (энергизованные митохон

-дрии в нулевой момент времени).

Для определения изменений рН матрикса, обусловленных транспортом K+, митохондрии нагружали рН-чувствительным зондом 2′7′-бис-(2-карбоксиэтил)-5(6)-карбоксифлуоресцеином, (BCECF, конечная концентрация 10 мкМ) [23]. Пробы инкубировали 10 мин (37 °С), после чего отмывали от зонда. Аликвоты (0,3 мг/мл протеи на) вносили в среду инкубации и реги

-стрировали флуоресценцию BCECF при длинах волн возбуждения и эмиссии 509 и 535 нм. Нахо

-дили разность между интенсивностью флуорес

-ценции зонда (F) и базальной флуоресценцией (F₀), которую определяли путем экстраполяции кинетических кривых к нулевому моменту вре

-мени. Количественную оценку изменений рН и транспорта протонов проводили с помощью калибровочных кривых, полученных методом потенциометрического титрования аликвот су

-спензии митохондрий добавлением раствора HCl в присутствии 5∙10-6 М ротенона и 10-6 М СССР с помощью стеклянного микроэлектрода, при параллельной регистрации флуоресценции BCECF в тех же условиях.

Образование АФК изучали по изменению флуоресценции дихлорофлуоресцеина [13]. Для этого митохондрии нагружали нефлуоресциру

-ющим проника-ющим зондом, 2′,7′-дигидроди-хлорофлуоресцеин диацетатом (DCFH-DA), который гидролизует в матриксе до непроникаю-щего производного (дигидрофлуоресцеина), и после окисления митохондриальными АФК об

-разует дихлорофлуоресцеин (DCF). Суспензию митохондрий нагружали DCFH-DA (конечная концентрация 200 мкМ) в течение 20 мин при 37 °C; после загрузки пробы и отмывки зонда (путем переосаждения митохондрий), суспен

-зию хранили на льду. Аликвоты суспензии (ко

-личество протеина 1 мг/мл) вносили в среду ин

-кубации, флуоресценцию DCF регистрировали при длинах волн возбуждения и эмиссии 504 и 525 нм. Из величины флуоресцентного сигнала (F) вычитали базальную флуоресценцию (F₀), которую находили путем экстраполяции кине

-тических кривых к нулевому моменту времени. Потребление кислорода изучали в стан

-дартных условиях полярографическим методом

в закрытой ячейке с платиновым электродом при 26° (конечная концентрация протеина 1,5– 2 мг/мл).

Диазоксид вносили в среду в заданных концентрациях. В зависимости от условий экс

-перимента в среду также вносили: CaCl₂, 1 мкМ циклоспорина А, ЭДТА, 5 мМ 4-аминопириди

-на (4-АП), 10-5 _{М глибенкламида, 1 мМ MgCl}

2,

0,3 мМ АТР, 5∙10-6 М ротенона, 10-6 М СССР (ко -нечные концентрации). Олигомицин вносили в количестве 1 мкг/мг протеина.

В работе использовали Na-глутамат, Na₂

-АТР, трис (основание), циклоспорин А (Fluka, Швейцария), диазоксид, 4-аминопиридин, гли

-бенкламид, ротенон, олигомицин, арсеназо-ІІІ, СССР, ЭДТА, 2′7′-бис-(2-карбоксиэтил)-5(6)-карбоксифлуоресцеин (BCECF), сафранин, 2′,7′-дигидродихлорофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA) (Sigma, США) и другие реактивы марки чда. Растворы готовили на бидистилля

-те. Достоверность результатов оценивали с по

-мощью парного t-критерия Стьюдента. р < 0,05 считали статистически значимой величиной.

результаты и обсуждение Влияние активатора K+

ATP-канала на K + -цикл в митохондриях печени крыс. Известно, что в присутствии проникающих анионов (фос

-фат, ацетат и др.) транспорт K+ через мембрану митохондрий сопряжен с переносом воды [24]. Набухание вследствие входа K+ в матрикс и со -кращение объема вследствие высвобождения K+ сопряжены с соответствующими изменения ми светопоглощения суспензии, снижением при на

-бухании и повышением при уменьшении объема митохондрий [5]. Это дает возможность спек

-трофотометрической регистрации обеих стадий K+-цикла – потенциалзависимого входа K+ и его выхода через K+_/H+-обменник в среду. Ранее мы показали [8], что после аккумуляции K+ в ма -триксе наступает состояние стационарного рав

-новесия между входом и выходом K+, которое со -ответствует стационарной скорости дыхания в состоянии 4 (при отсутствии ADP) и без измене

-ния объема митохондрий (рис. 1, А, 1). Мы пред

-ложили подход, позволяющий оценить влия ние активатора K+

ATP-канала на митохондриальный K+_/H+-обмен и выявить вклад K+

ATP-канала в трансмембранный обмен K+ путем селективного блокирования K+

митохондрий их неселективным блокатором 4-аминопиридином (4-АР) [8].

Так, в отсутствие Са2+ и циклоспоринчув -ствительного набухания митохондрий, изме

-нения митохондриального объема в основном обусловлены циклическим транспортом K+ [5]. В отсутствие блокаторов K+-каналов регистри -руемая скорость изменения светопоглощения

и митохондриального объема, V₀ (рис. 1, А, 1)

определяется суммой скоростей выхода K+ че -рез K+_/H+-обменник (_V

K/H), входа катиона через

K+

ATP-канал (VKATP) и потенциалзависимые K

+

-каналы (V_K): V₀ = V_K/H − V_KATP − VK (1). После се

-лективного блокирования K+

ATP-канала глибен -кламидом скорость изменения светопоглощения (V₁) равна разности скоростей выхода K+ через

рис. 1. Влияние блокаторов K+-каналов на светопоглощение суспензии митохондрий. А – светопогло -щение регистрировали в отсутствие блокаторов (1) и после внесения глибенкламида (2), глибенкла

-мида и 4-Ар (3). Б – амплитуда изменения поглощения после внесения глибенкла-мида (1) и 4-Ар (2). В – влияние DZ на изменение поглощения после блокирования входа K+, в относительных единицах, ΔA_rel = (A − A₀)/(A_max − A₀ ). г – линеаризация концентрационной зависимости (В) в координатах Хилла. В среду инкубации вносили: 1 мМ ЭДТА, 10-5 _{М глибенкламида, 5 мМ 4-Ар. M ± m, n = 6; * P < 0,05,}

достоверно относительно столбцов (1). по оси абсцисс: время, с (А); концентрация DZ, нМ (Б); ло

-гарифм концентрации DZ, [M] (В, г). по оси ординат: светопоглощение суспензии, А₅₂₀, усл. ед. (А); амплитуда изменения поглощения, ΔА₅₂₀ (Б); относительное изменение амплитуды поглощения, ΔArel (В); координаты Хилла: lg[A/(A_max − A)] (г)

0,12

А52

0

0,10

0,08

0,06

0,04

0,02

0

5 155 305 455 605 760

Время, c

3

2

1 А

Δ

А52

0

0,09

0,06

0,03

0

0 100 200 300

[DZ], нМ

2 1 Б

Аrel

1,00

0,75

0,50

0,25

0

-8 -7,25 -6,75 -6,25 lg[M]

В ₁

lg

[

v

/(

Vm

a

x

–

v

)]

-1

-2 0

Г

K+_/H+-обменник и входа через K+-каналы: _V 1 =

V_K/H − V_K (2). блокирование K+

ATP-канала совмест -но с потенциалзависимыми K+-каналами приво -дит к тому, что наблюдаемая скорость изменения светопоглощения (V₂) обусловлена в основном

работой K+_/H+-обмена: _V

2 = VK/H (3). Таким об -разом, из соотношений (1) и (2) следует, что на

-чальная скорость изменения светопоглощения, обусловленная активностью K+

ATP-канала в мо -мент его блокирования равна разности началь

-ных скоростей, регистрируемых в отсутствие блокаторов и после внесения глибенкламида:

V_KATP = V₁ − V₀ (4). Из (2) и (3) соответственно сле

-дует, что скорость изменения светопоглощения, обусловленная активностью потенциалзависи

-мых K+-каналов, равна разности начальных ско -ростей, регистрируемых после внесения 4-АР совместно с глибенкламидом (V₂) и после внесе

-ния глибенкламида (V₁): V_K = V₂ − V₁ (5). Следует

отметить, что условия спектрофотометрической оценки активности K+

ATP-канала близки к усло -виям полярографического метода, который ча

-сто используют [6, 7]. Данный подход позволяет выявить вклад K+

ATP-канала и АТР-независимых K+-каналов в K+-цикл в момент их блокирования соответствующими блокаторами.

Как показано нами ранее [8], внесение ди-азоксида приводит к активации K+_/H+-обмена и повышению начальной скорости и амплитуды сокращения объема митохондрий после бло

-кирования K+-каналов глибенкламидом, а так -же глибенкламидом и 4-АР (рис. 1, Б, столбцы

1, 2). Для оценки активирующего эффекта

ди-азоксида на K+_/H+-обмен амплитуду изменения светопоглощения после совместного внесения глибенкламида и 4-АР выражали в относитель

-ных единицах: ΔA_rel = (ΔA − ΔA₀)/(ΔA_max − ΔA₀), где ΔA₀ – изменение светопоглощения после блокирования входа K+ в контроле, а ΔA

max – при

максимальной активирующей концентрации диазоксида; ΔA – значения, полученные при раз

-ных концентрациях DZ (рис. 1, В). Линеариза

-ция установленной зависимости в координатах Хилла дает кажущуюся величину константы ак

-тивации K_1/2 ~130 нМ диазоксида (рис. 1, г). Судя по результатам экспериментов, акти

-вация K+_/H+-обмена диазоксидом (рис. 1, Б–г) происходит в области тех же концентраций активатора ≤500 нМ, при которых по нашим данным наблюдается ускорение дыхания в со

-стоянии 4 (K_1/2 ~ 140 нМ [11]), в соответствии с

активацией циклического транспорта K+ − входа K+ и K+_/H+-обмена. Как мы уже отмечали преж-де [8, 11], дальнейшее повышение концентрации DZ не приводит ни к дальнейшей активации K+_/H+-обмена, ни к увеличению ускорения ды -хания митохондрий. Таким образом, максималь

-ная активация K+-цикла происходит в области низких, наномолярных, концентраций диазок

-сида. Это указывает на высокое сродство K+

ATP

-канала нативных изолированных митохондрий к диазоксиду и соответствует данным литера

-туры, согласно которым активация реконструи-рованного K+

ATP-канала митохондрий печени ди -азоксидом происходит в наномолярной области концентраций активатора (K_1/2 ~ 350 нМ [25]). По нашим данным, АТР-зависимый вход K+ со -ставляет ~30% потенциалзависимого входа K+ в митохондриях печени [8]. При этом, несмотря на высокое сродство диазоксида к K+

ATP-каналу, ре -гистрация светопоглощения показывает также активацию АТР-независимого входа K+ при тех же концентрациях диазоксида (рис. 1, Б, столб

-цы 2), что мы отмечали уже ранее [8, 11]. Этот

вывод согласуется с результатами регистрации дыхания в состоянии 4. Так, путем селективно

-го блокирования K+

ATP-канала Mg∙ATP мы по -казали, что АТР-зависимая и АТР-независимая компоненты скорости дыхания в состоянии 4 составляют 4,0 ± 1,0 и 9,0 ± 1,2 в нативных митохондриях и, соответственно, 7,6 ± 1,3 и 12,6 ± 1,5 нг-ат. О∙мин-1_∙мг-1 _{в присутствии}

500 нМ диазоксида при использовании глутама

-та в качестве субстра-та дыхания [11].

чтобы убедиться в справедливости выво

-дов, сделанных на основании спектрофотоме

-трических и полярографических данных, нами также была поставлена задача изучить влияние диазоксида на активность K+

ATP-канала и мито -хондриальный K+_/H+-обмен путем регистрации транспорта протонов в митохондриях. Извест

-но, что транспорт K+ в митохондриях сопровож-дается эквивалентным (1 : 1) противоположно направленным транспортом ионов Н+ − из ма -трикса в среду при накоплении K+ и из среды в матрикс в ходе K+_/H+-обмена. Эти транспорт -ные процессы, в свою очередь, сопровождают

-ся изменениями рН матрикса – защелачиванием вследствие выхода протонов и закислением в ре

-зультате работы K+_/H+-обменника [13, 26]. Влия -ние диазоксида на транспорт протонов и рН ма

На рис. 2 представлены типичные данные, характеризующие влияние модуляторов по

-тенциалзависимого входа K+ на изменение рН матрикса митохондрий (ΔрН_i). Диазоксид вно

-сили в концентрации 500 нМ, соответствующей максимальной активации K+-цикла. Изучали влияние активатора K+

ATP-канала на начальную скорость транспорта Н+ (_V

0) и изменение рН ма

-трикса (ΔpH_i) в ходе накопления K+ (рис. 3, А, Б) и высвобождения катиона через K+_/H+-обменник в среду (рис. 3, В, г). АТР-зависимую компонен

-ту транспорта протонов оценивали путем блоки

-рования K+

ATP-канала, активированного 500 нМ диазоксида, Mg∙ATP, а также путем реактивации канала, заблокированного Mg∙АТР, внесением 50 мкМ диазоксида. Количественную оценку проводили с помощью калибровочных кривых, полученных в присутствии Mg2+ и Mg∙АТР.

Как и при использовании полярографиче

-ского метода [11], полученные результаты по

-казывают, что Mg2+ блокирует значительную часть потенциалзависимого входа K+ (рис. 3, А, Б, столбцы 1, 2) и подавляет K+_/H+-обмен (рис. 3, В, г, столбцы 1, 2), что согласуется с данными

литературы. В подтверждение наших прежних выводов о недостаточной селективности ди-азоксида [8, 11] регистрация pH_i также выявля

-ет активацию не только K+

ATP-канала (рис. 3, А, Б, столбцы 4), но и АТР-независимого входа K+ (рис. 3, А, Б, столбцы 1, 2). Так, вклад нативного

и активированного 500 нМ DZ K+

ATP-канала в V0 транспорта Н+ в условиях потенциалзависимого входа K+ составляет 44,0 ± 5,0 и 64,0 ± 6,0 нмоль Н+∙мин-1∙мг-1, что близко к результатам приве -денной выше полярографической оценки, ко

-торая (с учетом стехиометрии K/O = 10) дает 40 и 76 нмоль K+∙мин-1∙мг . При этом, по нашим данным, реактивация K+

ATP-канала 50 мкМ DZ в присутствии Mg∙ATP не повышает вклад K+

ATP

-канала в V₀ транспорта протонов и ΔpH_i (рис. 3,

А, Б, столбцы 4, 5). В присутствии 500 нМ DZ

повышается также скорость входа протонов в матрикс (рис. 3, В, столбцы 1, 2) и амплитуда из

-менения рН в результате накопления K+ (рис. 3, Б, столбцы 1, 2), что свидетельствует как о по

-вышении входа K+, так и об активации K+-цикла митохондрий. Активация K+

ATP-канала диазок -сидом также приводит к повышению его вклада в транспорт протонов и ΔpH_i (рис. 3, А–В, столб

-цы 4).

рис. 2. Влияние модуляторов транспорта K+ на рн матрикса митохондрий, типичные зави

-симости. В среду инкубации вносили: 0,01 мМ ЭДТА (1–6), 500 нМ DZ (2), 1 мМ MgCl₂, 500 нМ DZ (3), Mg∙ATP в отсутствие либо в присут

-ствии 500 нМ DZ (4), Mg∙ATP, 50 мкМ DZ (5), 50 мкМ DZ (6). по оси абсцисс: время, мин; по оси ординат: изменение рн от момента внесе

-ния митохондрий (ΔpH_i )

Δ

pH

i

0,09

0,06

0,03

0

0 2 4 6 5 10

Время, мин

2 1

4 3

6 5

Обращает на себя внимание сильное за

-щелачивание матрикса под действием 50 мкМ диазоксида, свидетельствующее о резком повы

-шении входа K+ по сравнению с таковым в на -тивных митохондриях (рис. 2, кривые 1, 5). При

этом вклад реактивированного K+

ATP-канала в транспорт Н+ остается на уровне АТР-зависимой компоненты транспорта, активированной 500 нМ диазоксида (рис. 2, кривые 3–5; рис. 3, А, Б, столбцы 4, 5). Это означает, что бóльшая

часть активированного высокими концентра

-циями диазоксида входа K+ происходит за счет АТР-независимого транспорта катиона и отно

-сится к неспецифическим эффектам DZ. Кроме того, высокие концентрации DZ, как показы

-вают данные, ингибируют K+_/H+-обмен (рис. 2, кривые 1, 6), что объясняет наблюдаемое нами

ранее отсутствие активации K+-цикла высокими концентрациями DZ при регистрации светопо

рис. 3. Влияние модуляторов трансмембранного обмена K+ на V

0 транспорта протонов и изменение рн матрикса (ΔpHi) в условиях накопления (А, Б) и выхода K

+ (В, г). V

0 и ΔpHi определяли в отсутствие (черные столбцы 1) и в присутствии 500 нМ DZ (белые и серые столбцы 2) при внесении в среду сле

-дующих добавок: 0,01 мМ ЭДТА (1–5), 1 мМ Mg2+ (2), Mg∙ATP (3). Определяли разность показателей в присутствии Mg2+ и Mg∙ATP (4), а также после внесения 50 мкМ DZ в присутствии Mg∙ATP (5). M ± m, n = 6. * P < 0,05, достоверно относительно контроля в отсутствие DZ (1–4, черные столбцы 1); # P < 0,05, достоверно относительно контроля в присутствии Mg∙ATP (столбец 1,3); ** P < 0,05, до

-стоверно относительно контроля, в отсутствие добавок (столбец 1,1)

200

V0

,н

м

ол

ь Н

+·м

ин

-1·м

г

-1

150

100

50

0

1 2 3 4 5

2 1 А

0,05

pH

i

0,04

0,03

0,02

0,01

0

1 2 3 4 5

2 1 Б

V0

,н

м

ол

ь Н

+·м

ин

-1·м

г

-1 30

20

10

0

1 2 3 4

2 1 В

Δ

pH

i

0,08

0,06

0,04

0,02

0

2 1 Г

1 2 3 4

K+_/H+-обмена также может объяснять и отмечен -ное торможение дыхания под действием диазок

-сида [20]. Таким образом, результаты, получен

-ные с помощью BCECF, подтверждают вывод об активации K+-цикла митохондрий наномоляр -ными концентрациями диазоксида и свидетель

-ствуют об активации АТР-независимого входа K+ помимо K+

ATP-канала в отсутствие Mg∙АТР. Влияние МрТр на трансмембранный обмен ионов в митохондриях. Открывание МРТР, как уже было показано нами [11], приводит к одно

K+ и Са2+. На рис. 4 приведены результаты реги -страции изменения митохондриального объема и светопоглощения, концентрации Са2+ в среде и ионов Н+ в матриксе (рис. 4, А–В) под действием

модуляторов K+- и Са2+-циклов в условиях обра -тимого открывания МРТР, не сопровождае мого деполяризацией митохондрий (рис. 4, г). Резуль

-таты экспериментов показывают, что K+-цикл совместно с МРТР участвует в поддержании равновесного митохондриального объема в ста

-ционарном состоянии, которое устанавливается после открывания МРТР и набухания митохон

-дрий, и при котором скорость изменения свето

-поглощения (V₀) практически равна нулю (рис. 4,

А, 1). Как и в случае одного лишь K+-цикла (рис. 1, А) блокирование отдельных компонент транспорта позволяет выявить их участие в ре

-гуляции объема митохондрий. Так, внесение не

-селективного блокатора потенциалзависимых K+-каналов 4-АР приводит к повышению свето -поглощения (рис. 4, А, 2), что указывает на уча

-стие K+-каналов в регуляции объема матрикса при открывании МРТР. Таким образом, в равно

-весных условиях в регуляции объе ма матрикса участвуют МРТР, K+-каналы и K+_/H+-обмен, ко -торые и определяют наблюдаемую скорость из

-менения светопоглощения (рис. 4, А, 1):

V₀ = V_K/H − V_MPTP − V_K (1),

где V_K/H – скорость сокращения объема вслед

-ствие K+_/H+-обмена, _V

MPTP и VK – скорость набу

-хания вследствие работы МРТР и K+-каналов. После блокирования K+-каналов в регуляции митохондриального объема участвуют только K+_/H+-обмен и МРТР (рис. 4, А, ₂):

V₁ = V_K/H − V_MPTP (2).

блокирование МРТР циклоспорином А (рис. 4, А, 3) приводит к тому, что наблюдаемое повышение светопоглощения и уменьшение объема митохондрий происходит в результате работы K+_/H+-обмена в условиях одновремен -ного входа Са2+ в матрикс (_V

2 = VK/H (3)) либо в условиях полного удаления Са2+ ЭДТА (_V

3 = VK/H

(4)), после чего K+_/H+-обмен восстанавливает митохондриальный объем до первоначального (рис. 4, А, 4). Как показано [21], вход Са2+ в ма -трикс после внесения циклоспорина А (рис. 4, Б, 2) приводит к ингибированию K+_/H+-обмена и снижает амплитуду сокращения объема мито

-хондрий (рис. 4, А, 3, 4).

Как следует из (1) и (2), доля K+-каналов в регуляции объема митохондрий определяется разностью скоростей изменения светопогло

-щения в отсутствие блокаторов (V₀) и в момент

блокирования K+-каналов 4-АР (_V

1): VK = V1 − V0.

В то же время, вклад МРТР соответствует цик-лоспоринчувствительной разности начальных скоростей изменения объема в отсутствие и в присутствии циклоспорина А (рис. 4, А, 2, 3): V_MPTP = V₂ − V₁. Циклоспоринчувствительное из

-менение объема митохондрий оценивали в усло

-виях одновременного блокирования K+-каналов 4-АР. Внесение блокатора K+-каналов показы -вает их участие в поддержании равновесного объема при открывании МРТР. 4-АР не влияет на циклоспоринчувствительный транспорт Са2+ (рис. 4, Б) и соответственно на оценку вклада МРТР в регуляцию объема матрикса.

Согласно данным (рис. 4, Б), при открыва

-нии МРТР происходит также активация Са2+ -цикла, который поддерживается одновременной работой МРТР и Са2+-унипортера. Открывание МРТР вследствие входа Са2+ в матрикс приво -дит к циклоспоринчувствительному высвобож

-дению Са2+ (рис. 4, Б, ₁) и приводит к стацио -нарному равновесию, при котором наблюдаемая скорость транспорта Са2+ (_V

0) является резуль

-татом одновременной работы Са2+-унипортера (V_Са), МРТР (V_МРТР) и Са2+/Н+-обмена (_V

Са/Н) и

равна нулю. Активностью Са2+/Н+-обмена в ус -ловиях эксперимента можно пренебречь, из чего следует, что V₀ = V_МРТР − V_Са (5). блокирование

МРТР позволяет регистрировать вход Са2+ через Са2+-унипортер (рис. 4, Б, ₂): _V

1 = VСа (6). Соот

-ветственно из (5), активность МРТР опреде

-ляется суммой скоростей V₁ + V₀, и поскольку V₀ = 0, V_МРТР = V₁. Поэтому вход Са2+ в матрикс после блокирования МРТР циклоспорином А свидетельствует о функциональной активности как МРТР, так и Са2+-унипортера, которые вмес-те поддерживают Са2+-цикл при открывании МРТР.

если равновесное распределение Са2+ под -держивается работой только Са2+-транспортных систем, то в регистрируемом распределении ио

-нов Н+ после выхода Са2+ через пору участвует также и K+-цикл (рис. 4, В). Скорость транспор -та протонов в состоянии равновесия (V₀) равна

сумме скоростей их входа в матрикс через пору (V_МРТР), выхода из матрикса вследствие потенци

рис. 4. Влияние модуляторов МрТр и транспорта K+ на светопоглощение суспензии митохондрий (А), концентрацию са2+ в среде (Б), рн матрикса (В) и мембранный потенциал митохондрий печени (г). Изменение параметров регистрировали от момента внесения митохондрий в среду. Внесение 4-Ар (А, кривые 2–4), циклоспорина А (А, кривая 3; Б, В, кривые 2; г, кривая 3), 0,01 мМ ЭДТА (Б, В, кривая 3; А, г, кривая 4) указано стрелкой. са2+ вносили в среду инкубации в концентрации 10 мкМ. В, кривая 4 – митохондрии вносили в среду в присутствии 0,01 мМ ЭДТА. г, кривые 1 и 2 соответствуют внесению митохондрий в среду в присутствии (1) и в отсутствие (2) циклоспорина А. по оси абсцисс: время, мин; по оси ординат: светопоглощение, А₅₂₀ (А); поглощение в присутствии арсеназо-III, А_654/700 (Б); изменение рн матрикса, Δрн_i (В); мембранный потенциал, ΔΨ_m, % от контроля. За 100% принимали ΔΨm в начальный момент времени. стрелкой обозначена циклоспоринчувствительная разность на -чальных скоростей изменения параметров, пояснения в тексте

0,6

А520

0,4

0,2

0

0 4 8 12

Время, мин

1 А

V₀ V₁ V₂

V₃

2 4

3 А

65

4/

70

0

0,20

0,16

0,12

0,04

0 3 6 9 Б

Время, мин

V₁

2

3

1 V₀

0,08

Δ

pH

i

0,100

0,075

0,050

0,025

0

0 4 8 12 16

Время, мин

3 2 1

В

V₁

V₂

4

V₀

ΔΨ

m

,

% 75

50

25

0

0 2 4 6 8 Г

Время, мин

100

2

4 1

(V_Са), а также входа в матрикс в результате K+_/H+ -обмена (V_K/Н): V₀ = V_Са − V_K/Н − V_МРТР (7). блоки

-рование МРТР циклоспорином А (рис. 4, В, 2) приводит к входу протонов в матрикс вслед

-ствие работы Са2+-унипортера и K+_/H+-обмена:

V₁ = V_Са − V_K/Н (8). Из приведенных соотношений

следует, что как и в других случаях (рис. 4, А, Б), активность МРТР характеризуется разно

-стью скоростей транспорта ионов Н+ в отсут -ствие и в присутствии циклоспорина А (рис. 4, В, 1, 2): V_МРТР = V₁ − V₀ (9). Как и в случае све

-топоглощения, элиминация Са2+-цикла позво -ляет регистрировать вход протонов в матрикс вследствие работы K+_/H+-обмена (рис. 4, А, ₄; В, 3): V₂ = V_K/Н (10). Открывание МРТР приводит

к активации K+_/H+-обмена (рис. 4, В, 3, ₄), что соответствует данным, полученным при реги

-страции светопоглощения, которые показывают повышение скорости и амплитуды сокращения объема митохондрий по сравнению с контролем (рис. 1, А, 3; рис. 4, А, 4). Скорость транспорта

протонов в матрикс возрастает с 23,0 ± 4,0 нмоль Н+∙мин-1∙мг-1 до 60 ± 7 нмоль Н+∙мин-1∙мг-1, что соответствует наблюдаемому нами ранее уско

-рению дыхания в состоянии 4 при открывании МРТР по сравнению с контролем от 11,5 ± 1,2 до 28 ± 2 нг-ат. О∙мин-1_∙мг-1 _{[11]. Таким образом,}

активация K+-цикла при открывании МРТР про -исходит за счет активации K+_/H+-обмена, тогда как ускорение Са2+-цикла обусловлено работой МРТР. Следует отметить, что открывание МРТР приводит к более сильному защелачиванию ма

-трикса (рис. 4, В, 1–3) по сравнению с контролем в бескальциевой среде (рис. 4, В, 4). Согласно

с данными литературы, наблюдаемый эффект можно объяснить одновременным входом K+ и Са2+ в случае МРТР, бóльшим связыванием ка -тионов в матриксе и высвобождением бóльшего количества ионов Н+ из матрикса в среду, что и ведет к повышению pH_i [13, 26]. При этом бы

-стрый трансмембранный обмен ионов K+, Са2+ и Н+, несмотря на активацию K+_/H+-обмена, под -держивает высокий стационарный уровень вну

-тримитохондриального рН (рис. 4, В, 1).

Известно, что скорость дыхания в состоя

-нии 4 контролируется циклическим транспор

-том протонов, Н+-циклом, в котором скорость выхода протонов вследствие работы дыхатель

-ной цепи равна скорости потенциалзависимого входа ионов Н+ в матрикс через Н+-проводящие структуры мембраны [27]. При открывании

МРТР циклический транспорт Са2+, поддержи -ваемый МРТР и Са2+-унипортером, вносит вклад в скорость дыхания и Н+-цикл митохондрий, по -скольку вход Са2+ в матрикс сопровождается эк -вивалентным выходом Н+ вследствие работы ды -хательной цепи, тогда как выход Са2+ через пору сопровождается входом Н+ в матрикс вследствие показанного нами ранее циклоспоринчувстви

-тельного Са2+:Н+-обмена [28].

Как показано выше (рис. 4, Б), стационар

-ная скорость дыхания в условиях функциональ

-но актив-ной МРТР поддерживается равенством скоростей входа Са2+ через унипортер и высво -бождения через пору. Поскольку обе компо

-ненты в равной мере обеспечивают Са2+-цикл, блокирование каждой из них должно в равной мере снижать скорость дыхания митохондрий. Сказанное подтверждается результатами бло

-кирования МРТР и Са2+-унипортера соответ -ственно циклоспорином А и рутениевым крас

-ным, которые показывают примерно равный их вклад в скорость дыхания митохондрий (рис. 5, А, столбцы 1, 2).

Влияние активатора K+

ATP-канала на об -разование АФк в условиях открывания МрТр. Согласно результатам эксперимента активация K+

ATP-канала диазоксидом приводит к снижению вклада циклоспоринчувствительной компонен

-ты как в скорость дыхания, так и в регуляцию митохондриального объема (рис. 5, А, Б), что свидетельствует о подавлении функциональ

-ной активности МРТР. Наблюдается корреляция между активацией K+_/H+-обмена с повышением концентрации диазоксида (рис. 1, Б, В) и сниже

-нием активности МРТР (рис. 5, Б, столбцы 1, 2).

В то же время возрастает циклоспориннечув

-ствительная компонента регуляции митохон

-дриального объема, обусловленная активностью K+_/H+-обмена (рис. 5, В, ₁, ₂). Закономерно сде -лать вывод, что повышение активности K+_/H+ -обмена под действием активатора K+

ATP-канала приводит к ингибированию МРТР.

Согласно с существующими представления-ми подавление МРТР лежит в основе цитопро

-текторного действия активаторов K+

ATP-канала [2, 3, 12, 15]. Однако молекулярные механиз

-мы блокирования МРТР при активации K+

ATP

-канала все еще неясны. Можно предположить, что комплексная модуляция функционального состояния митохондрий приводит в действие це

рис. 5. Влияние DZ на циклоспоринчувствительную компоненту скорости дыхания и сокращения объема митохондрий. А – Вклад МрТр (1) и са2+-унипортера (2) в скорость дыхания в состоянии 4 оценивали по разности, соответственно, в отсутствие и в присутствии 1 мкМ циклоспорина А (1) и 10 мкМ рутениевого красного (2). Б – Влияние DZ на циклоспоринчувствительную компоненту скорости дыхания оценивали в отсутствие (1) и в присутствии 500 нМ DZ (2). В – Вклад МрТр и K+/H+-обмена в начальную скорость сокращения объема (ΔV

rel ) оценивали в относительных едини -цах, принимая максимальную скорость сокращения объема после блокирования МрТр и K+-каналов (V₂ – V₀ ) за 1. В этом случае вклад МрТр (ΔV₁ ) и K+/H+-обмена (ΔV

2 ) в регуляцию объема митохондрий соответственно составляет: ΔV₁ = (V₂ – V₁ )/(V₂ – V₀ ) и Δ V₂ = (V₁ – V₀)/( V₂ – V₀ ) (рис. 4, А, пояснения в тексте). са2+ вносили в концентрации 10 мкМ. M ± m, n = 4; *P < 0,05, достоверно относительно столбцов 1; # P < 0,05, достоверно относительно нулевого значения в отсутствие добавленного са2+ (Б, столбцы 1). по оси абсцисс: количество добавленного са2+, нмоль∙мг-1 (А, Б); концентрация DZ, нМ (В)

10,0

Δ

JO2

,н

г-ат

. О

·м

ин

-1·м

г

-1

7,5

5,0

2,5

0

0 20 40 60 2 1 А

Ca2+, нмоль_·мг-1

10,0

7,5

5,0

2,5

0

2 1 Б

Δ

JO2

,н

г-ат

. О

·м

ин

-1·м

г

-1

0 50 10 15 20 Ca2+, нмоль_·мг-1

1,0

Δ

Vre

l

0,75

0,50

0,25

0

0 200 400 В

[DZ], нМ

2

1

МРТР, и активация K+_/H+-обмена под действием диазоксида (рис. 1, В, рис. 5, В, 2) является не

единственной причиной наблюдаемого умень

-шения активности МРТР (рис. 5, Б, столбцы 2).

Известно, что АФК являются триггерами от