M I
C
H A E L F
O
R B E
S
P I E
H
L E R
.O p
t i m i
z at i
o n of m i
c r ob i
al d i
e s el f
u el d
eg
r ad
at i
o n a nd N 2 f i
x at i
o ni
n a ch
r o ni
c al ly
p
oll
ut
ed
em b
ay m
e nt
(
u nd
e rt h
ed i
r e ct i
o n of D
r.H
.W
.P
a e rl
)
A
b
st
r a ct
I
nt h i
s st
ud
y
ap
et
r ol
e um h y d
r o c a rb
o nb i
or em
ed
i
al t
e ch
ni
q
u ew
a sd
e si
g
n ed
f
o r e n cl
o s ed m
a ri
n e e n vi
r o nm
e nt
s.A
n att
em
p
t w
a sm
ad
et
od
et
e rm i
n e c o nd it i
o n s op
ti m
al f
o rb
ot
h
m i
c r ob i
al N 2 f i
x at i
o n a nd p
et
r ol
e um h
y
d
r o c a rb
o nd
eg
r ad
ati
o n.P
a rt i
c ul
at
e o rg
a ni
c c a rb
o n{
Sp
a rti
n a al t
e r ni fl
o r a)
,i
n e rt
p
a rt i
cl
e s(
ny l
o n s c r e e n a nd
g
l
a s sfi l
te rp
a rti
cl
e s)
,d i
s s ol
v ed
o rg
a ni
c c a rb
o n(
D O C
)
,t
r a c em
et
al
s, a nd
i
n o rg
a ni
c n ut
ri
e nt
sw
e r e ad d
ed i
nd i
vi
d
u al l
y
a nd
i
n com b i
n at i
o nt
om
a xi m i
z et h
et w
om i
c r ob
i
al
p
r o c e ss e s.T h
eg
r e at
e st i
n c r e a s ei
np
et
r ol
e um h y d
r o c a rb
o nd
eg
r ad
at i
o nw
a s ob
t
ai
n ed
by
t h
e ad
d it i
o n of
Sp
a rti
n ap
a rt
i
cl
e s and i
n o rg
a ni
c nit
r og
e n a nd
p
h
o sp
h
o n j s(
S
N P
)
.P
a rt i
c ul
at
e o rg
a ni
c c a rb
o nw
a si
nt
eg
r al i
n a ny
t
reat m
e nt
s u c c e s sf
ul i
n st i m
ul
at i
ng p
etr ol
e um h y
d
r o c a rb
o nd
eg
r ad
ati
o n.N 2 f i
x ati
o n r at
e sw it h d i
e s el f
u el
p
r e s e nt c o uld
n ot b
em
e a s u r ed
u si
ng
t h
e a c et
y
l
e n e r ed
u ct i
o n a s s ay
b
e c a u s e of
v ol
at i
l
e em i
ssi
o n of
et h
y
l
en e(
or ag
ast h
at
c o -el
ut
esw i t h
et h
y
l
e n e o n a nf l
am
ei
o ni
z at
i
o nd
et
e ct
o r{
F I D
})
f
r om t h
ep
et
r ol
e um
p
r od
u ct
.A
ck
n ow l
ed
g m
e nt
sT h i
sw
o rk w
a sm
ad
ep
o s sib l
ew i
th
a s si
sta n c e a nd
s up p
o rt fr om
a n um b
e r of
p
e op
l
e .I w
o ul
d
l ik
et
ot h
a nk D
r.H
a n sP
a e rl f
o ri
n v al
u ab
l
e a ssi
st
a n c ew it h
e v e ry p
h
a se of t h i
s st
ud
y
.D
r.F
r ed
e ri
cP f
a e nd
e rl
e nt i
n si
g
ht d
u ri
ng
t h
ed
e si
g
n of
t h i
sp
r oj
e ct
a nd
w
a s a s o u r c e of
ad
vi
c et h
r o ug
h
o ut
.T
h
a nk
s al
sot
oD
r.M
i
ch
a el
A it k
e nf
o r s e r vi
ng
o nm
y
c om m itt
e e.S p
e ci
al t h
a nk
sg
ot
oB
et
sy D
om i
ni
ck f
o rh
e r u nd
e r st
a nd i
ng
a nd
s up
p
o rtd
u ri
ng
th
e a s s em b ly
of
th i
sw
o rk
a nd
tom y f
am il y f
o r th
ei
r s upp
o rt
a nd
ed it
o ri
al p
r ow
e s s.T
ab l
e of
C
o nt
e nt
sA
ck
n ow l
ed g m
e nt
sii
L i
st
of F i
g
u r e s vi
I
.I
nt
r od
u ct i
o n1
A
.T h
eP
r ob
l
em
1
B
.A P
o s si b l
eB i
o r em
ed i
al T
e ch
ni
q
u e3
C
.B
a ck
g
r o u nd I
nf
o rm
at i
o n4
1
.R
eg
ul
at i
o n of N 2 F i
x ati
o n4
2
.R
eg
ul
at i
o n of P
et
r ol
e um H
y d
r o c a rb
o nD
eg
r ad
at i
o n8
3
.M i
c r ob i
al A tt
a ch m
e nt
1 5
II
.O b
j
e ct i
v e s1 7
II I
.E
xp
e ri m
e nt
al M
at
e ri
al
s a nd M
et h
od
s1 8
A
.S
t
ud y
S
i t
e1 8
B
.A
ss ay
s1 8
1
.P
r ep
ar at i
o n of
A
d d
it i
o n s1 9
2
.D
et
e rm i
n at i
o n of N 2 F i
x at i
o nP
ot
e nt i
al
s2 2
3
.D
et
e rm i
n ati
o n of D i
e s el D
eg
r ad
ati
o n2 4
4
.S p
e ci
al E
xp
e ri m
e nt
al
C
o nd i
ti
o n s2 6
C
.S
t
at i
st i
c al
A
n al
y
si
s2 7
I
V
.R
e s ul
t
s2 8
A
D
i
l D
r ad
ti
2 8
V
.D i
s c u s si
o n4 9
A
.N 2 F i
x ati
o n4 9
B
.D
i
e s el D
eg
r ad
ati
on5 0
V I
.C
o n cl
u si
o n s5 7
I
.I
nt
rod
u ct i
o nA
.T h
eP
rob l
em
P
et
r ol
e um h
y d
r o c a rb
on s a r et h
em
o st
c om m
o nf
am i ly
of
a nth
r op
og
e ni
cp
ol l
ut
a nt
si
nt h
em
a ri
n e e n vi
r o nm
e nt
.T h
ey
a r ei
nt
r od
u c ed t h
r o ug
h m
a ny
m
e a n s ,t h
em
o st
c om m
o n of w h i
ch
a r el
e ak i
ng
t
a nk
s a nd p
i
p
el
i
n e s,l
o ad
i
ng
a nd
u nl
o ad i
ng
of
sh i
p
s ,t
r u ck
s, a nd b
a rg
e s, a nd
i
nf
r eq
u e nt b
ut
c at
a st
r op
h i
cl
a rg
e v ol
um
e sp i
l l
s.T h
e r ei
s a n u n e v e nd
i
st ri
b
ut i
o n of
p
et
r ol
e um h
y d
r o c a rb
o np
oll
ut i
o ni
nt h
em
a ri
n e e n vi
r o nm
e nt
,w it h t h
e c o n sid
e r ab l
em
aj
o rit y
of it
o c c u r ri
ng
i
nb
ay
s,h
a rb
o r s, a nd
e st
u a ri
e s(
L
e vy
et
al
.,1 9 8 1
)
.T h
eh
et
e r og
e n eit y
of t h
e se rec ei
vi
ng
e n vi
r o nm
e nt
s a nd t h
e v a ri
et y
a nd
com
p
l
e xit
y
of t h
ep
et
r ol
eum h
y d
r oca rb
o np
oll
ut i
o nh
a v em
ad
eg
e n e r al i
z at i
o n s ab
o ut t h
ef
at
e a nd t
r a n sp
o rt
of t h
e s e s ub
st
a n c e sd if fi
c ult
d
e sp
it
e c o n si
d
e r ab l
e st
ud
y
.T h
o ug h b
ay
s ,h
a rb
o r s, a nd
e st
u ari
e s r e c ei
v et h
em
aj
o ri
ty
of
p
et
r ol
e um
h
y d
r o c a rb
o np
oll
ut i
o ni
nt h
em
ari
n e e n vi
r o nm
e nt
,l
a rg
e s c al
e sp
i l l
si
nt h
e s e a r e a s a r e n ot
c om m
o n.W
h
at
a r e al l t
oo com m
o n,t h
o ug
h
, a r e sm
al l t
om
ed i
um
si
z ed
sp
i l l
s of
af
ew h
u nd
r ed t
o at h
o u s a nd g
al l
o n s.A m
aj
o rp
r ob
l
em i
sf
o rm
ul
at i
ng
a s et
of
c o st
ef f
e ct i
v et
ech
ni
q
u e st
od
e al w it h t h
e s e en vi
r o nm
e nt
al l
y
r el
e v a nt
sp
i l l
sw h i
ch
a r e n eit h
e r eff
e ct i
v el
y
n o r eff i
ci
e nt l
y d
e alt w it h b
y
m
et h
od
sd
e si
g
n ed t
o cl
e a n up
l
a rg
e s c al
e sp
i l l
sT h
ed
e si
g
n of
r em
ed
i
al t
e ch
ni
q
u e sf
o rt h
e s e sm
all
e rs
p
i l l
sm
u st
a c c o u nt f
o rt h
e e c ol
og
i
c al
c om p l
e xit y
of
th
eb
ay
s,h
a rb
o r s , a nd
e st
u a ri
e sb y w
ei
g
h i
ng
t h
e c o st
s a nd b
e n ef it
s of
th
e r em
ed i
al
eff
o rt
.T h
ef
ate of
c r ud
e a nd
r ef i
n ed p
et
r ol
e um p
r od
u ct
si
nt h
em
a ri
n e e n vi
r o nm
e nt i
si
nf l
u e n c ed
b y m
a ny
f
a ct
o r s ,i
n cl
ud i
ng
ty
p
e a nd
am
o u nt of
p
ol l
uti
o n,t
em
p
e r atu r e ,h y d
r od
y
n am i
c s of t h
e e n vi
r o nm
e nt, r a te s of
v ol
at i li
z at i
o n a nd
s ol
ub i li
z ati
o n, a nd
v a ri
o u st
r a n sf
o rm
at i
o np
r o c e s s e s th
at m
ay
o c c u r att h
e si t
e(
N
at i
o n al R
e s e a r ch
C
o u n ci l
,1 9 8 5
)
.B i
o r em
ed
i
at i
o n of
b
ot
h
c r ud
e a nd
r ef i
n ed
p
et
r ol
e um i
nt h
em
a ri
n e e n vi
r o nm
e nt h
a sb
e e nd
e s c ri b
ed i
nm
a ny
st
ud i
e s(
A
tl
a s ,1 9 8 1 ; F l
o od
g
at
e,19 8 4
;P
ri
tch
a rd
a nd
C
o st
a ,1 9 9 1
;P
ri
n c e,1 9 9 2
)
.M i
c r o o rg
a ni
sm
s c ap
ab
l
e of
ut i l i
zi
ng p
et
r ol
e um h
y d
r o c a rb
o n s ap p
e a r ub i
q
uit
o u si
nt
h
em
ari
n e e n vi
r o nm
e nt
(
A t l
a s ,19 8 1 ; F l
o od
g
at
e ,1 9 8 4
;P ri
n c e ,1 9 9 2
)
.If t h
ei
nd i
g
e n o u sm i
c r of l
o r ah
a v et h
e ab
i l it
y
t
od
eg
r ad
ep
et
r ol
e um h
y d
r o c a rb
o n s a nd
a r e n ot
d
oi
ng
s o at
a r e a s o n ab
l
e r at
e,t h
e nt h
e e n vi
r o nm
e nt
al
c o n st
r ai
nt
s at t
h
e sit
e of t h
e sp
i ll m
ay b
e c o ntr ol li
ng
t h
el
e v el
of m i
c r ob i
al d
eg
r ad
at i
o n.I
n sp
i ll
sit
u at i
o n s , a s u rf
ei t
of
c a rb
o ni
s a v ail
ab l
e tot h
em i
c r ob i
al
c om m
u ni t
y
.T h
e r at
e at w h i
ch t h i
s c a rb
o n c a nb
e ut i li
z ed
i
sli m it
ed
b
y
t h
e a v ai
l
ab
il it
y
of
n ut ri
e nt
s a nd th
ep
h
y
si
c al
e n vi
r o nm
e nt
.G
e n e r al ly
, o xy
g
e n, nit
r og
e n, a nd p
h
o sp
h
o r u s , a r et
h
em
aj
o rm
ol
e c ul
a r c o n st it
u e nt
st h
at li m it
o r c o nt
r ol t h
ebi
od
eg
rad
at
i
o np
r oce s s e s(
N
at
i
o n al
R
e s e a r ch
C
o u n ci l
,1 9 8 5
)
.M
u ch
of
t
h
em
ari
ne en vi
ronm
e nt i
sw
el l
o xy g
e n at
ed
a nd h
asb i
ol
og
i
c all
y
a v ai l
ab l
ep
h
o sp
h
or u sl
e v el
s suffi
ci
e nt f
o rg
r ow t
h
(
P
a r son s , et
al
.,1 9 7 7
;F
alk
ow
sk i
,1 9 8 0
)
.T h i
si m
p
li
c at
e s ni
tr og
e n a s th
ep
ri m
a ry
l i m i
ti
ng
f
a ct
o r(
D
ug
d
al
e ,1 9 6 7 ;
R y
t h
e r a nd
D
u n st
a n,1 9 7 1
)
.I
nl
ow
e n e rg y
c o a stal
a r e a sw it h l
a rg
ep
etr ol
e um
co n c e nt
r at i
o n s , o xy g
e n a nd
nit
r og
e nm
ay
c o -r eg
ul
at
el
e v el
s of
p
et
r ol
e um
d
eg
r ad
at i
o n.A
c om m
o nb i
o r em
ed
i
al t
ech
ni
q
u ef
o r sp i
ll
ed p
et
r ol
e um h
a sb
e e nt
oa
d
d
nit
r og
e n a nd
/
o rp
h
o sp
h
o r u st
o al l
ow t h
em i
c r ob
i
al
c om m
u nit
y
t
o ut i l
i
z et
h
e c a rb
o n s o u r c ep
r o vi d
ed b y t h
ep
etr ol
e um h y d
r o c a rb
o n s(
P
ri
n c e,1 9 9 2
)
.C
o a stal d
e v el
op
m
e nt i
n th U
nit
ed S t
at
e sh
a sb
e e ni
n c r e a si
ng
at
ad
r am
at i
c r at
e .W
it h t h
ei
n c r e a s ed d
e v el
op
m
e nt h
a s c om
e ad
d
it i
o n al
r e c r e at i
o n al
u s e of
c o a st
al w
at
e r s .M
o r eh
e ad
C
i t
y
,N
ort h
C
a r ol i
n ai
s sit
u at
ed
o nB
og
u eS
o u nd
a nd h
a s s e ve r al
n a vig
ab l
e ch
a n n el
sw h i
ch
r u n th
r o ug
h
th
e a r e a .N
e a rb y
B
e a uf
ort I
nl
et
al l
ow
s e a sy
a c c e s st
ot h
eA t l
a nt i
cO
c e a n, a nd
t h
ei
nt
e r c o a st
al
W
at
e n w ay
r u n sd i
r e ct ly t h
r o ug
h t h
e a r e a.T h
e s ef
a ct
o r s a nd m
a ny
ot h
e r s c o nt ri b
ut
et
om
ak
e th
e a r e a v e ry p
op
ul
a rf
o r r e c r e at i
o n al b
o at
e r s.T h
e r ei
s al
s o con si d
e r ab l
e c om m
e r ci
al b
o at t
r aff i
cw h i
ch
c o n si
st
s of fi
sh i
ng
a nd
sh i
p p
i
ng
ves s el
s.P
et
r ol
e um
p
ol l
ut i
o ni
nt h
ew
at
e rw
ay
s ,p
ort
s, a nd m
ari
n a si
s a n u nf
ort
u n at
eb
y p
r od
u ct
of t h
eh
ea vy
m
ari
n et
raff i
ci
nt h
e a r e a.E
n cl
o s ed
a r e a s s u ch
a sm
ari
n a sf
r eq
u e nt l
y
a r e e xp
o s ed t
o sm
al l
sp
i ll
s a s a r e s ult
of
o v e r-fi ll i
ng
of
g
a st
a nk
s a nd
ot h
e r st
a nd
a rd b
o at i
ng
op
e r at i
o n s.T h
e r ei
s a n e ed
f
o r ab i
o r em
edi
al
t
e ch
ni
q
uet
od
e al w it
h
t h
e s e sm
all
sp
il l
s,w h i
ch
a s ag
r o up
c o n st it
ut
e al
arg
ep
ort i
o n of m
ari
n ep
et
r ol
e um
p
oll
uti
o n.B
.A P
o s sib
l
eB i
o rem
ed i
al T
e ch
ni
q
u eT h
e op
t i m
al b
i
o r em
ed i
al t
e ch
ni
q
u ew
o uld b
e o n et h
at
e a s ed
li m it
at i
o n s of
f
a ct
o rs c o nt
r ol li
ng
t h
em i
cr ob
i
al
d
eg
r ad
at i
v ep
ot
e nti
al w i t
h
o ut
add
i
ng
e x c e ssi
ve am
o u nt
s of
e x og
e n o u sm
at
eri
al
s o r n ut ri
e nt
s.T h i
sm
et h
od
w
o uld
al
l
ow t
h
et
l
t
m t
it h t h
l
t
i b l
i m p
t
i
t
f
t i
i
g
(
e c ol
og y
a nd
n utri
e nt cy
cl i
ng
)
.I
n th
e o ry
,t h i
sm
et h
od w
o uld
r ed
u c et h
e ri
sk
of
n ui
s a n c eb l
o om
s a nd
s e v e r ep
e rt
u rb
at i
o n si
ni
nte r n al
n utri
e nt cy
cli
ng
w h i
ch m
ay
r e s ul
tw h
e nl
a rg
e am
o u nt
s of i
n o rg
a ni
c n ut
ri
e nt
s a r e ad d
ed t
o am
a ri
n e sy
st
em
.T h i
sw
o rk
e x am i
n ed t h
e eff
e ct i
v e n e s s of
ad d i
ti
o n s of i
n o rg
a ni
c n ut
ri
e nt
s,p
a rti
c ul
at
e o rg
a ni
c c a rb
o n s ub
st
r at
e ,i
n e rt p
a rti
cl
e s ,d i
s s ol
v ed
o rg
a ni
c c a rb
o n, a nd
tr a c em
etal
si
n v a ri
o u s c om b i
n at i
o n s.N
at
u r all y
o c c u r ri
ng S
p
a rti
n a al t
e r ni fl
o r aw
a s ch
o s e n a st h
e c a rb
o n s ub
st
r at
e .T h
e ad d
it i
o n of
Sp
a rti
n ah
a sb
ee nf
o u nd t
o st i m
ul
at
em i
c r ob i
al N 2 f i
x ati
o ni
nm
a ny
st
ud i
e s(
P
a e rl
a nd
C
a rlt
o n,1 9 8 8
;P
a e rl
et
al
. ,1 9 8 7 ; P
a e rl
a nd
P
r uf
e rt
,1 9 8 7
)
.S
i
g
nif i
c a nt N 2 f i
x ati
o nh
a sb
e e nd
et
e ct
ed i
np
etr ol
e um h y d
r o c a rb
o nd
eg
r ad i
ng
sy
stem
s(
L
ag
u e r r e et
al
. ,1 9 8 7
;T
o c c al i
n o e t al
. ,1 9 9 3
)
.It w
a sh y p
oth
e si
z ed
th
at t h
e ad d it i
o n of S
p
a rti
n a al t
e r ni fl
o r ap
a rti
cl
es a nd
n ut
ri
e nt
sw
o uld
c o -op
t i m i
z e c o nd it i
o n sf
o rN 2 fi
x at i
o n a nd
p
et
r ol
e um h
y
d
r o c a rb
o nd
eg
r ad
at i
o n,i
n c r e asi
ng
t h
ep
ot
e nt i
al f
o rp
et
r ol
e um
h y
d
r o c a rb
ond
eg
r ad
ati
o nb
y p
rovid i
ng
a ni
nt
e r n al
s o u r c e of
"n ew
" ni t
r og
e n.C
.B
a ck
g
r o u nd I
nf
o rm
at
i
o n1
.R
eg
ul
at i
o n of N 2 F i
x at i
o nM
u ch
of t h
em
a ri
n e e n vi
r o nm
e nt h
a s s up
p ly
r at
e s of b i
ol
og
i
c al ly
a v ai l
ab l
e nit
r og
e nl
ow
e n o ug
h t
oli m it
g
r ow t h
a nd m
et
ab
oli
c a cti
vi
ty
i
nt h
em i
c r ob i
al
c om m
u nit
y
.T
h
eN
o rt
h C
a r oli
n a c o ast
al
r eg
i
o ni
s an ex am
p
l
e of t h i
st
y p
e of
sy
st
em
(
T h
ay
e r,1 9 7 4
;R
ud
ek
et
al
. ,1 9 9 1
)
.D
e sp
it
et h
e ni t
r og
e nd
efi
ci
e n cy i
nt h
er e
g
io n, h ig
h le v e ls ofN
2f
ixati
o nh
ave n otb
e e n c o n si
ste nt ly
ob
s e r v ed
.T h
eq
u e st i
o n of w h y
th
e r ei
s n ' t sig
ni fi
c a ntN 2 fi
x ati
o ni
n th i
s e n vi
r o nm
e ntw h
e r e c ond
it i
o n s aff
o rd
a c om
p
et it i
v e ad
v a nt
ag
et
o o rg
ani
sm
s c ap
ab
l
e of m
e eti
ng
t h
ei
r ow
n nit
r og
e n n e ed
s r em
ai
n st
ob
e a n sw
e r ed
.C
l
e a rly
,t h
e r e a r ef
a ct
o r si
n th
em
a ri
n e e n vi
r o nm
e nt
ot h
e rt h
a n nit
r og
e nli m it
at i
o nli m it i
ng
t h
el
e v el
s of N 2 f i
x at i
o n.T h
e r e a r e a n um b
e r of p h y
si
c al f
a cto r si
n th
em
a ri
n e e n vi
r o nm
e ntw h i
ch
i
nf l
u e n c e nit
r og
e n a s e a cti
vi
ty
.I
r r ad i
a n c e , tem p
e r atu r e, a nd t
u rb
ul
e n c e c a n aff
e ct
N 2 f i
x at i
o n eit h
e ri
nd i
vi
d
u al ly
o r sy
n e rg
i
st i
c all
y
(
P
a e rl
,1 9 9 0
)
.N 2 f i
xi
ng
cy
a n ob
a ct
e ri
al g
e n e r at
e nd t
o o c c u ri
nw
a rm
e r a nd h
i
g
h l
y
i
r r ad
i
at
ed
w
at
e r s a nd
t
e nd t
op
e rf
o rm b
et
te r at t h
e s u rf
a c e of t h
ew
ate r(
P
a e rl
et
al
. ,1 9 8 7
)
.I
n c r e a s ed
i
r r ad
i
a n c e c a ni
nd i
r e ct l
y
i
nh i
b
it N 2 fi
x at i
o nby
all
ow i
ng
f
o ri
n c r e a s ed
p
h
ot
o sy
nt
h
e si
s.T h i
s r e s ult
si
nh i
g
h
e rO
2
c o n c e nt
r at i
o n s,w h i
ch i
nh i
b
it t h
e a cti
vit
y
of t h
e nit
r og
e n a s e e n zy m
e .N i
tr og
e n a s e a ct i
vi
ty i
n s om
ed i
a z ot
r op
h
s c a nb
em
axi m
i
z ed d
u ri
ng p
eri
od
s of
d
a rk
n e s sb
e c a u s e, o n c et h
e s u n s et
s ,t h
el
e v el
of
o xy g
e np
r od
u ci
ng p
h
ot
o sy
nt h
e si
sd
ecli
n e sq
ui
ck l
y
.T h
em
a xi m
um
ni t
r og
e nas e a cti
vit y i
sf
r eq
u e nt l
y
ob
s e r v ed i
nt h
ef i
r st 1
-3 h
o u r sf
ol l
ow i
ng
t h
e o n s et of
d
a rk
n e s s(
P
a e rl
a nd
C
a rlt
o n,1 9 8 8
)
.T
u rb
ul
e n c e c a nd
e c r e a s el
e v el
s of N 2
f
i
x at i
o ni
n s e ver al w
ay
s.I
t
ca nm
o v eN
2
fi
xi
ng
o rg
a ni
sm
s aw
ay
f
r om t
h
em
o st
f
a v o r ab
l
e e n vi
r o nm
e nt
,it
c a n e nh
a n c eO
2 d if f
u si
o ni
ntoN 2 f i
xi
ng
m i
c r o e n vi
r o nm
e nt
s, a nd
it
c a n c a u s e r e s u sp
e n si
on of
n ut
ri
e nt
sf
rom t
h
eb
ott
om
w
h
i
ch
c ani
ncr e a se am m
o ni
um
c o n c ent
r ati
o n st
o al
e v el w h
e r eN 2 f i
x at i
o nw i l l
h
alt
(
P
a e rl
,1 9 9 0
)
.A l
a ck
of
g
e n eti
ci
nf
o rm
ati
o ni
s n ot r e sp
o n sib l
ef
o r th
eli m i
tati
o n of
p
ot
e nt
i
al N
2
f i
x at
i
o nl
evel
s.T h
e ni f
g
e n ew h i
ch
c od
e sf
o r nit
r og
e n a s e ,t h
e e n z e r e sp
o n sib
l
ef
o rN 2 f i
x at i
o ni
sh i
g
h l
y
c o n s e r v ed
a nd
ub i
q
uit
o u si
nt h
em
ari
ne e n v ir o nm
ent(
Pa e rl, 1 9 9 0)
. A not herp
o s sib le lim
it ing f
a cto ri
s avai l
ab i li
t y of m
et
al
c of
a ct
o r s s u ch
a sm
ol
y
b d
e n um
a nd i
r o n.T h
e nit
r og
e n a s e e n zy m
e c om
p
l
e x c om
p
ri
s e st w
o s ub
-u nit
s.T h
ef i
r sti
s a ni
r o n -c o nt
ai
ni
ng p
r otei
nd
i
ni t
r og
e n a s e r ed
u ct
a s e a nd t h
e ot h
e r am
ol
y
b d
e n um
-a nd i
r o n -c o nt
ai
ni
ng
p
r ot
ei
nd
i
ni t
r og
e n a s e(
B
u rg
e s s,1 9 8 4
)
.H
ow
a rth
a nd C
ol
e(
1 9 8 5
)
p
r op
o s ed t h
at
m
oly b d
e n um
up
tak
el
e v el
s c o ul d li m it
nit
r og
e n a s e a cti
vi
ty
.T h
ei
r c o n cl
u si
o nw
a sb
a s ed l
a rg
ely
o n th
ei d
e a th
at c o n c e ntr at i
o n s of
s ulf
ate , a st
r u ctu r al
a n al
og
of
m
ol
y b
d
at
e , a r eh i
g h
e n o ug h
I
nm
u ch
of
t h
em
a ri
n e e n vi
r o nm
ent t
op
r od
u ce a ni
nh i
b
it i
o n of m
ol
y
b
d
at
e up
t
ak
eb y m i
c r o o rg
a ni
sm
s.P
a e rl
et
al
.(
1 9 8 7
)
f
o u nd t h
at
c o n c e nt
r at i
o n s of
a v ail
ab l
em
oly b d
e n um
a nd
i
r o ni
nt h
e e n vi
r o nm
e nt
e x c e ed
ed
t h
e n eed
s of N 2 f i
x e r s o nt h
eN
o rt h
C
a rol i
n a c o a st
.A l
s o, n ut
ri
e nt
b
i
o a s s ay
si
nt h
eC
a ri
b b
ea n a nd
t h
eN
o rth
C
a r oli
n a coa st h
a v e sh
ow
n n o e vi
d
e n c e of
li
m it
at i
o n of
nit
r og
e n a s e a ct i
vi
ty d
u et
o s c a r city
of m
oly b d
ate .F
ew
st
ud
i
e sh
a v ei
n v e st i
g
at
ed p
o s sib l
eli m
i
t
at
i
o nb y
ot h
e rt
r a c em
et
al
s s u ch
a s c op p
e r, zi
n c,m
a ng
a n e s e, c ob
alt
, o rb
o r o n.P
a e rl
et
al
.f
o u nd t h
e r ew
a s n oli m it
at i
o n of
nit
r og
e n a s e a ct i
vit y d
u et
o c o n c e ntr at i
o n s of
a ny
of t h
e s em
et
al
si
n c o a st
al w
at
e r s(
1 9 8 7
)
.T h
e c o n si
st
e nt l
y
n eg
at i
v e r e s ul
ts ob
t
ai
n ed
r eg
a rd i
ng
eff
e ct
s of t
r a c em
et
al
s o n nit
r og
e n a s e a ct i
vit y d
o n ot
r ul
e o ut t h
ep
o s si b il it y
of
a n a sy
et
u nd i
s c o v e r ed
tr a c em
etal im p
a ct
.F
u rt h
e ri
n v e sti g
a ti
o ni
s c e rtai
nly
w
a r r a nt
ed
.I
n e n vi
r o nm
e nt
sw h
e r e al l
of t h
e n ut
ri
e nt
r eq
ui
r em
e nt
sf
o rd
i
a z ot
r op
h
s a r em
et
a nd
t h
e ab
o v em
e nti
o n ed
p
h
y
si
c al f
a ct
o r sf
a v o r nit
r og
e n a s e a ct i
vit y
,N 2
f i
x at i
o n ap p
e a r st
op
r o vi
d
e o nl
y
a sm
all f
r a ct i
o n of t h
e ni t
r og
e nd
em
a nd
of t h
e sy
st
em
(
H
ow
a rt h
et
al
,1 9 8 8
)
.N it
r og
e nf i
x e r s r eq
ui
r eb
ot h
a n ad
eq
u ate e n e rgy
(
c a rb
o n)
s o u r c e a nd
a r e a sw i
t hd
ep
leted
o xy g
e n le vels.T
he s e a n o xi
c z o n e s c a no c c ur o n
p
a rti
cle s a nd b
iof i lm
s o r c a n r e s ul
tf
r om
oxy g
e ng
r ad i
e ntsi
nt h
ew
at
e r c ol
um
n o r n e a r s ed
i m
e nt
s(
P
a e rl
,1 9 9 0
)
.T h
eN
o rt h
C
a r ol i
n a c o a st
al
z o n ei
s ni
tr og
e nli m i
ted b
ut
o nly l
ow l
e v el
s of N 2 f i
x at i
o n a r e ob
s e n / ed
.N
ei
th
e r s al i
nit y
n o rp
H
r eg
i m
e si
nh i b i t
nit
r og
e n a s e a ct i
vi t
y
.T h
em
aj
o rit y
of t h
e nit
r og
e n a s e a ct i
vit
y
o c c u r s o n s u rf
a c e sw it h
a v ai l
ab
l
e o rg
a ni
cm
at t
e r a nd
a s u r r o u nd i
ng
o xy g
e ng
r ad i
e nt
(
P
a e rl
et
al
,1 9 8 7
)
.R
ed
u c ed
z o n e s a r o u nd
t h
e s u rf
a c e s c a nb
ed
et
e ct
ed
u si
ng
t
et
r a z ol i
um
s al
t ad
d
it i
o n s a nd m i
c r o el
e ct
r od
e st
o ch
a r a ct
e ri
z e o xy g
e ng
r ad
i
e nt
s(
P
a e rl
a nd P
r uf
e rt
,1
9 8
7
)
.R
ed
uc ed
a n o xi
cm
i
c r o zon e s c an o c c u ri
nd
etri
tu s,m i
c r ob
i
al m
ats, a nd
c el l
ag
g
r eg
ati
o n s , a nd w h
e nt h
e s e z o n e s a r ep
r e s e nt
,N 2 fi
x a ti
o ni
sm
o r eli k
el y t
o o c c u r.T h
ed i
st
u rb
a n c e of
a r ed
u c ed
a n o xi
cm i
c r o z o n eby
m
i
xi
ng
o rd
i
ff
u si
o n of
o xy g
e nh
alt
s nit
r og
e n a s e a ct i
vit
y
(
B
eb
out
et
al
,1 9 8 7
)
.P
a e rl
a nd
C
a rlt
o n e x am i
n ed t h
e eff
e ct of
ad d i
ng
v a ri
o u s o rg
a ni
c a nd
I
n o rg
ani
c ca rb
o n s ub
st
r at
e s, al
o n e a nd
i
n c o nj
u n cti
o nw it h
al
ab
i l
ed
i
s s ol
v ed
c a rb
o n s o u r c e(
m
a n ni
tol
)
.T h
ey
ad d
ed tw
ot y p
e s of p l
a nt d
et
rit
u s{
S
p
a rti
n a a nd
Z
o st
e r a)
a nd
tw
oi
n o rg
a ni
c s ub
str at
e s(
ny l
o n s c r e e ni
ng
a nd g l
a s sf ib
e rf i l
te r s)
.I
n al l b
ut t h
eg
l
a s sfi l
te r c a s e nit
r og
e n a s e a cti
vi
ty
w
a sd
ete ct
ed
(
vi
a a c et y l
e n e red
u ct
i
on)
w h
e n onl
y
a s ub
st
r at
ew
a s ad d
ed
.T
h
eh
ig
h
e st
d
et
e ct
ed
l
e v el w
a s o nt h
e o rg
a ni
cZ
o st
e r ap
a rt i
cl
e s.I
n al l
c a s e sw it h
nit
r og
e n a s e a ct i
vi
ty
a n o xy
g
e ng
r ad
i
e nt w
a sd
et
ect
ed
a r o u nd
t h
e s u rf
a c e of t h
e s ub
str at
e u si
ng
m i
c r o el
e ct
r od
e s .T h
em
a xi m
um
nit
r og
e n a s e a ct i
vit y l
e v el
sw
e r ef
o u nd w i
th t h
e ad d it i
o n of
a sub
st
r at
e a nd
a s o u r c e of d i
s s ol
v ed
o rg
a ni
cm
at te r.I
nt h
e s e c a s e st h
e s u rf i
ci
al
o xy
g
e ng
r adi
e nt w
a sm
o r ep
ronou n c ed
.T h i
si
s at t
ri
b
ut
ed
t
ot h
em
et
ab
oli
sm
of
t h
ed i
s s ol
v ed
o rg
a ni
c c a rb
o nb y t h
e nit
r og
e nf i
x e r s a nd
att
a ch
ed b
a ct
e ri
a c a u si
ng
a r ed
u c ed
m i
c r o z o n et
of
o rm
A
dd
it i
o n al t
e st
sw
e r ep
e rf
o rm
ed w i
th
p
h
o sp
h
o n j sm
o ly b d
e n um
, an d iron ad de d a lo n e and
In c om
b in at io nw
it h t he sub
str ate .T
he s et
ri
al
s r e v e al
ed
n o ad
d it i
o n al i
n c r e a s ei
n ni t
r og
e n a s e a ct i
vit
y
a s a r e s ult
of t h
e n ut
ri
e nt
a nd m
etal
ad d i
ti
o n s(
P
a e rl
a nd C
a rlt
o n ,1 9 8 8
)
.D
e ad
a nd
s e n e s c e nt
p
l
a nt m
at
e ri
al h
a sb
e e n sh
ow
nt
oi
n c r e a s eN 2
f i
x at i
o nb
y p
rovid i
ng
a s o u r c e of
c a rb
o n a nd
e n e rgy
i
nm
a ny
ag
ri
c ult
u r al
sy
st
em
s(
H
i l l a nd P
atri q
uin , 19 8 8
;H
al
s al l
a nd G i b
s o n,19 8 9
; a nd R
op
e r a nd S m i
th
,1 9 9 1
)
.T h
e ad d it i
o n of
ag
ri
c ul
tu r al w
a st
e sh
a sb
e e n sh
ow
n to sti m
ul
ateN 2 f i
x at i
o ni
nt h
em
a ri
n e e n vi
r o nm
e nt
(
B
eb
o ut
a nd
P
a e rl
,1 9 8 8
)
.B
eb
o ut
a nd
P
a e rl
al
s of
o u nd
t h
at
t h
e ad d
it i
o n of
sm
al l
p
a rti
cl
e s of
st
e ril
e c o r n sl
a sh
r e s ul t
ed
i
n a ni
n c r e a s ei
n nit
r og
e n a s e a ct i
vi ty i
nt h
e n at
u r al ly
o c c u r ri
ng
m i
c r ob i
al
c om m
u nit y
.R
ed
u c ed
m i
c r o z o n e s a nd
o xy g
e ng
r ad
i
e nt
sw
e r ef
o u nd
a rou nd
t h
ep
a rt i
cl
e s .2
.R
eg
ul
at i
o n of P
et
r ol
e um
H
y d
r o c a rb
o nB i
od
eg
r ad
at i
onI
n1 9 4
6 C
l
a ud
eZ
oB
ell w
r ot
et h
efi
r st m
aj
o r r e vi
ew
of
st
ud
i
e s e x am i
ni
ng
t h
e r ol
e of m i
c r o o rg
a ni
sm
si
nd
eg
r ad i
ng
h
y
d
r o c a rb
o n s.I
nt h i
s r e vi
ew h
em
ad
e a n um
b
er of
ob
ser v at i
o n s ab
o ut t h
e a cti
vit
y
of m i
c r o o rg
a ni
sm
s o nh y d
r o c a rb
o n s .H
e st
at
ed
t h
at
ali
p
h
at i
c , ol
efi
ni
c , a r om
at i
c , a nd
n ap
h t h
e ni
ch y
d
r o carb
o n si
ng
a s,li
q
uid
, a nd
s ol id
p
h
a s e s ap p
e a r ed t
ob
e s u s c ep t i b l
e tod
eg
r ad
at i
o nb y
m i
c r o o rg
a ni
sm
s.H
ef
o u nd
ali
p
h
at i
ch
y d
r o c a rb
o n st
ob
et h
em
o st
e a si l
y
o xid i
z ed
by
m
i
c r o o rg
a ni
sm
s.Z
oB
el l
al
s o st
at
ed
t h
at t h
e ab
i lit
y
t
o ut i li
z ehy d
r o c a rb
o n s a s a s o u r c e of
c a rb
o n a nd
e n e rg y w
a sw id
e sp
r e ad
am
o ng
m i
c r o o rg
a ni
sm
s .N
e a rly
1
00
sp
e ci
e s of b
act
eri
a ,f
u ng
i
,y
ea st
s , a nd m
old
sw
e r e s aid t
ob
e c ap
ab l
e of
att a ck in