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reproductivo se mantuvieron a una temperatura de 26 ± 1ºC y un fotoperíodo de 12:12.

ENSAYOS IN VITRO

La metodología de los ensayos in vitro, destinados a evaluar el efecto de diferentes factores hormonales y neuroendocrinos sobre ovario y hepatopáncreas de C. quadricarinatus, se basó en trabajos previos desarrollados en crustáceos decápodos por Rodríguez et al. (2002); Zapata et al. (2003), Medesani et al. (2004) y Cahansky et al. (2008b, 2011).

Incubación de tejidos

Una vez pesados el ovario y hepatopáncreas disecados de cada animal, se procedió a la fragmentación de dichos órganos en al menos cuatro piezas de 0,1 a 0,3 g (5 a 10 mm. de largo, aproximadamente) utilizando bisturí y pinza de disección. Cada pieza de tejido, correspondiente a un determinado tratamiento, fue colocada en un pocillo de una placa de cultivo estéril de 12 pocillos (Costar ® 3516 de Corming Inc, USA). Cada pocillo fue llenado previamente con 2 mL de medio de cultivo M199 (Sigma®) suplementado con: penicilina G (100 unidades/mL), estreptomicina (0,1 mg/mL), PMSF (0,1 mM), suero fetal bovino (10% v/v) y EDTA (5% v/v). La osmolaridad del medio de cultivo (14,55 g/L) terminó de ajustarse finamente mediante el agregado de sal marina artificial (HW Marinemix®), de acuerdo a parámetros establecidos en trabajos previos (Soroka et al, 2000; Khalaila et al., 2002; Meng & Zou, 2009).

Para conseguir la concentración deseada de hormona o neuroregulador, se adicionó a cada pocillo una alícuota (15 l) de una solución concentrada de la sustancia a ensayarse, o bien del vehículo utilizado, según el diseño experimental establecido. Este último fue disecado de cada hembra, dividido en dos mitades. Una mitad fue asignada al tratamiento con sólo ovario y GT y la restante al tratamiento con ovario, GT y naloxona. En estos casos, el grupo control recibió un fragmento de músculo del quelípedo o del abdomen, de tamaño similar al ganglio torácico, como control de tejido. La co-incubación con GT se realizó a fin de trabajar directamente con la fuente productora de GSH y de encefalinas para evaluar el efecto de la naloxona sobre el sistema encefalinérgico.

VARIABLES MEDIDAS

Los ensayos in vitro realizados durante la Tesis comprendieron la determinación de los niveles de vitelogenina, o bien de la tasa de síntesis proteica, de acuerdo con la metodología detallada a continuación.

a. Determinación de los niveles de vitelina y vitelogenina

Estos ensayos in vitro fueron realizados durante los tres períodos del ciclo reproductivo de C. quadricarinatus, a fin de evaluar el efecto de distintas hormonas y neuroreguladores sobre los niveles de vitelogenina en ovario y hepatopáncreas. Las placas de cultivo fueron incubadas durante 20 h en oscuridad constante, en estufa de cultivo con atmósfera controlada (5% de CO2) a 28°C. Luego de la incubación, las piezas de ovario y

hepatopáncreas de cada pocillo fueron retiradas, colocadas en tubos Eppendorf y tratadas según el protocolo descrito anteriormente en el Capítulo II (ver Metodología: Obtención y

procesamiento de muestras de ovario y hepatopáncreas para determinación de vitelogenina por la técnica ELISA).

b. Estimación de la tasa de síntesis de Proteínas

Estos ensayos in vitro fueron realizados en los tres períodos del ciclo reproductivo de hembras de C. quadricarinatus a fin de evaluar el efecto del metil farnesoato sobre la tasa de síntesis de proteínas en ovario y hepatopáncreas. Los diferentes pocillos de las placas donde se incubó el tejido con la hormona ensayada recibió además, una alícuota 3µCi de leucina 3H, midiéndose la incorporación de este aminoácido radioactivo a las proteínas ováricas y hepatopancréaticas sintetizadas de novo, como método directo de cuantificación del crecimiento ovárico. Esta metodología, basada en ensayos previos del grupo de trabajo se resume a continuación.

Las placas fueron incubadas en cámara con atmósfera controlada (5% de CO2) a

28°C, en condiciones de oscuridad constante durante 20 horas, luego de lo cual cada pieza ovárica fue secada en papel de filtro y pesada. Cada pieza de tejido se colocó en un volumen de 2 mL de ácido tricloroácetico (TCA) 10% frío y se homogeneizó manualmente en homogeneizador de vidrio con émbolo de teflón; los homogenatos obtenidos fueron colocados en tubos Eppendorf de 2 mL y centrifugados a 10.000 xg durante 10 min, en centrífuga Eppendorf® 5415D a 4°C. Se descartó el sobrenadante y cada pellet fue resuspendido en 2mL de TCA 10% y filtrado. Los filtros conteniendo las muestras fueron transferidos a viales conteniendo 2 mL de solución centelladora (OPTIPHASE Hi Safe 2), donde permanecieron 24 h a 4°C, hasta la posterior determinación de las CPM (cuentas por

minuto) en contador de centelleo (Beckman®). Los valores de CPM registrados fueron relativizados al peso de la pieza ovárica, quedando expresados como CPM/g de ovario.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Para el análisis de los resultados obtenidos in vitro se empleó el software Statistica versión 7.0. Se aplicó un ANOVA de medidas repetidas seguido de un test de comparaciones planeadas (LSD) (Sokal y Rohlf, 1981). Además, se aplicó un ANOVA de un factor para la comparación de los GSI y HSI entre períodos. El nivel de confianza fue del 5%.

A. EFECTO IN VITRO DE LA HORMONA METIL FARNESOATO SOBRE OVARIO Y HEPATOPÁNCREAS

DISEÑO EXPERIMENTAL

En estos ensayo se incubaron piezas de ovario (OV) y hepatopáncreas (HP) con tres concentraciones de metil farnesoato (MF): 0,15 (MF I); 1,5 (MF II) y 15 (MF III) µM, equivalentes a la concentración máxima esperada en hemolinfa luego de la inyección de 10-9, 10-8 y 10-7 moles / langosta, respectivamente. Cada vial recibió 15 µl de la droga ensayada mientras que los grupos controles (CT) recibieron una alícuota similar de etanol absoluto (EtOH), vehículo de disolución del MF.

El metil farnesoato (trans-trans), se sintetizó a partir de geranilacetona comercial en el Departamento de Química Orgánica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires, de acuerdo con la metodología de Rodríguez & Gros (1990), siendo gentilmente donada por el primero de estos dos autores. Como vehículo de disolución de esta hormona se utilizó etanol absoluto (p.a. 99% pureza).

PRIMER EXPERIMENTO: EFECTO DEL METIL FARNESOATO SOBRE EL