Qualitative analysis

DISEÑO EXPERIMENTAL

Los ensayos se realizaron en diferentes períodos del ciclo reproductivo, según se detalla a continuación:

o reproductivo: 30 de noviembre de 2010. Peso promedio de las hembras: 53,46 ±

6,25g (N=10)

o post-reproductivo: 19 de mayo de 2011. Peso promedio de las hembras: 45,43 ±

1,85g (N=11)

o reproductivo temprano: 3 de octubre de 2011. Peso promedio de las hembras: 65,26

± 2,86 g (N=10)

Para estos ensayos in vitro se incubaron piezas de ovario, con el agregado de

Naloxona (Sigma Chemical Co. St. Louis, Mo: catálogo N7758), a una concentración

de 125µM, utilizada en trabajos previos con la misma especie (Cahansky et al., 2008, 2011). Las piezas fueron colocadas en tubos viales que recibieron 15 µl de la droga ensayada; en el caso de los grupos controles (CT) se agregó 15 µl de dimetil sulfóxido (DMSO), vehículo de disolución del Nx. Las piezas ováricas (OV) fueron coincubadas con ganglio torácico o bien, con músculo de la quela (M) en el caso de los grupos controles. El agregado de ganglio torácico (GT) se realizó a fin de trabajar con la la fuente productora de GSH y evaluar así el efecto positivo del antagonista encefalinergico naloxona sobre la maduración ovárica y/o vitelogénesis. De esta forma

se pretende estimular la secreción de GSH al deshinbir el efecto negativo de las encefalinas producidas por el ganglio torácico, logrando finalmente un efecto indirecto sobre la vitelogénesis endógena.

Los grupos experimentales fueron los siguientes:

1) OV+ M+ CT: pieza ovárica + músculo+ vehiculo (control) 2) OV+ M+ NX: pieza ovárica + músculo + naloxona

3) OV+GT+CT: pieza ovárica + ½ ganglio torácico+ vehiculo (control) 4) OV+GT+NX: pieza ovárica + ½ ganglio torácico + naloxona

RESULTADOS

En la Tabla 7 se muestran los valores promedios de los IGS e IHS calculados en las hembras utilizadas en los ensayos con Nx. Al comparar los valores del IGS, se observaron diferencias significativas (p<0,05) entre los tres periodos considerados, observándose los menores valores en el post reproductivo, y los mayores en el reproductivo. En este último periodo, las hembras en periodo reproductivo presentaron un índice hepatosomático significativamente mayor (p<0,05) respecto a los otros dos.

Periodo IGS IHS

Reproductivo 3,44± 0,52 a 5,58± 0,23 a

Post- reproductivo 0,35± 0,07 b 5,27 ± 0,18 b

Tabla 7. Índices gonadosomático (IGS) y hepatosomático (IHS) de hembras de C.

quadricarinatus en los diferentes experimentos in vitro realizados con naloxona (Nx) Letras distintas indican diferencias significativas (p<0,05) entre períodos, para cada índice.

Con respecto al contenido de vitelina en ovario, no se observaron diferencias significativas (p >0,05) entre los grupos experimentales ensayados, según se muestra en la Figura 32.

Figura 32. Niveles promedio de vitelina (Vg) detectados en ovario (OV) de hembras adultas

de C. quadricarinatus en los cuatro grupos experimentales ensayados in vitro por periodo. M: músculo; CT: control; NX: naloxona; GT: ganglio torácico.

DISCUSIÓN

Se sabe que en crustáceos el sistema opioide está involucrado en la regulación del desarrollo ovárico. Tantos estudios in vivo como in vitro han aportado fuerte evidencia al respecto (Fingerman et al., 1985; Sarojini et al., 1995, 1996, 1997; Cahasnky et al., 2008, 2011). Fingerman (1997) ha propuesto que el mecanismo de acción de los neuropéptidos opiodes, met- y leu-encefalinas, sería la inhibición de la secreción de la GSH y/o la estimulación de la secreción de GIH. En contraposición, un inhibidor de opioides endógenos como el naloxona, es capaz de inducir la maduración ovárica en crustáceos al anular los efectos de los opioides endógenos mencionados. (Sarojini et al, 1995, 1996, 1997; Kishori & Reddy, 2003).

Varios ensayos in vitro realizados en P. clarkii prueban la acción inhibitoria de la met-encefalina sobre la maduración ovárica, mediante la administración de su antagonista, la naloxona. Sarojini et al. (1997) mediante experimentos de incubación de ovario con ganglio torácico, a distintas concentraciones de met-encefalina y de Nx, observaron por un lado que el efecto estimulador del ganglio torácico fue bloqueado por la acción inhibitoria de las met-encefalina de manera dependiente de la concentración. Por otro lado, la Nx, incrementó de manera significativa el crecimiento del ovario en presencia del ganglio torácico, en comparación con el tratamiento con ganglio torácico sólo. De manera similar, los ensayos in vitro llevados a cabo en C. quadricarinatus por Cahansky et al. (2008), demuestran que al incubar fragmentos de ovario con ganglio torácico y Nx (a 125 µM), aumenta significativamente el crecimiento ovárico (en términos de incorporación de leucina tritiada) respecto del control. Los resultados de estos trabajos, estarían indicando que la Nx potencia la acción estimuladora del ganglio

torácico sobre la secreción de GSH y en consecuencia sobre la síntesis de proteínas del ovario.

El efecto in vitro de antagonistas dopaminérgicos y encefalinérgicos sobre el crecimiento ovárico fue además realizado en distintos periodos del ciclo reproductivo de

C. quadricarinatus (Cahansky et al., 2011). Durante el periodo post-reproductivo, al

agregar Nx al ovario co-incubado con ganglio torácico, se obtuvo un crecimiento significativo del ovario, mientras que en el periodo pre-reproductivo no se observaron diferencias estadísticamente significativas.

Sin embargo, en la presente Tesis no se obtuvieron resultados significativos respecto al contenido de Vn al incubar ovario con ganglio torácico y Nx en ninguno de los tres periodos del ciclo reproductivo. Esto podría indicar que la GSH, cuya secreción es inducida por el naloxona en el ganglio torácico, no estaría involucrada directamente en el proceso específico de vitelogénesis, aunque tendría efecto sobre la síntesis de otras proteínas ováricas.

Al respecto, Ward et al. (2009) identificaron en el cangrejo C. pagarus, mediante espectrometría de masas, las proteínas constituyentes del ovario, entre las que se encuentran además de la vitelogenina y vitelina, proteínas estructurales (actina y tubulina), de transporte, de choque térmico (HSP), cierta variedad de enzimas, subunidades de hemocianina y ferritrina entre otras proteínas con funciones heterogéneas. Navakanitworakul et al. (2012) mencionan que en el camarón

F.merguiensis, las proteínas ribosomales, están implicadas en la síntesis general de

et al. (2011) reportan además, dos proteínas multifuncionales, tranglutaminasa y

tioredoxina, que estarían involucradas también en la maduración ovárica de P. monodon con posibles implicancias sobre la vitelogénesis y fertilización. Ante estos recientes hallazgos, y en base a lo obtenido en la presente investigación, es posible que el efecto principal de la GSH sea estimular, en una primera etapa, la síntesis de proteínas ováricas estructurales que preparen al ovario para iniciar el proceso específico de vitelogénesis.

CAPÍTULO IV