Accelerator Grid Erosion

El conjunto de herramientas y el campo de estudio destinados a la caracterizaci´on y an´alisis de la totalidad de los genomas microbianos presentes en una muestra ambiental se denomina ”Metagen´omi- ca”[Riesenfeld et al., 2004]. Si bien las estrategias metagen´omicas presentan desv´ıos y limitaciones, este abordaje permite acceder al potencial gen´etico contenido en una comunidad microbiana de forma mucho m´as completa [Ferrer et al., 2009, Simon y Daniel, 2009]. La alta diversidad que presentan los microorganismos en las comunidades microbianas representa el mayor desaf´ıo de este nuevo campo de estudio. Sin embargo, esta diversidad presenta tambi´en un gran valor, y la metagen´omica representa una disciplina clave para acceder a dicho potencial. La metagen´omica est´a contribuyendo a incremen- tar nuestro conocimiento sobre el rol que presentan los microorganismos para el funcionamiento de los ecosistemas de nuestro planeta, a conocer las distintas especializaciones que han adquirido a lo largo de su evoluci´on, y a revelar sus posibles utilidades biotecnol´ogicas [Brown y Tiedje, 2011]. Por medio de dos estrategias diferentes, estas herramientas permiten analizar el ADN de la comunidad sin utilizar un paso previo de amplificaci´on. Ambas se describen brevemente a continuaci´on.

1.3.3.1. Bibliotecas metagen´omicas

De forma similar a las bibilioteas gen´omicas, la construcci´on de una biblioteca metagen´omica consiste en el clonado de ADN metagen´omico en vectores adecuados, y la posterior transformaci´on de la c´elula hospedadora. De acuerdo al vector utilizado, es posible generar dos tipos de bibliotecas metagen´omicas, aquellas que contienen insertos menores a 10 kb, los cuales son clonados en vectores plasm´ıdicos, y las que poseen insertos de hasta 40 kb o mayores (clonados en c´osmidos, f´osmidos o BACs). La construcci´on de uno u otro tipo de biblioteca depender´a del tama˜no de los fragmentos obtenidos durante la extracci´on de ADN metagen´omico, de la estrategia de b´usqueda seleccionada para identificar los clones de inter´es, del hospedador y del n´umero clones requerido para que la biblioteca sea representativa del metagenoma, entre otros factores [Daniel, 2005]. Generalmente, las bibliotecas metagen´omicas en pl´asmidos son empleadas para la identificaci´on de nuevas biomol´eculas codificadas por un s´olo gen u oper´on peque˜no. Sin embargo, para poder identificar rutas metab´olicas codificadas por varios genes, o fragmentos de ADN destinados a la caracterizaci´on gen´omica de microorganismos no cutivables, es conveniente la construcci´on de una biblioteca en c´osmidos, f´osmidos o BACs [Simon y Daniel, 2011]. Aunque la construcci´on de una biblioteca metagen´omica es conceptualmente simple, se requiere de un gran n´umero de clones a fin de lograr una adecuada cobertura del an´alisis de la comunidad en estudio.

La identificaci´on de los clones conteniendo genes de inter´es involucra estrategias de b´usqueda basadas en las secuencias de nucle´otidos de los genes en estudio o en la determinaci´on una actividad

enzim´atica [Simon y Daniel, 2011]. Los an´alisis basados en secuencias nucleot´ıdicas incluyen el uso de t´ecnicas moleculares como PCR o hibridaci´on. Debido a que estas t´ecnicas utilizan cebadores o sondas dise˜nados a partir de regiones conservadas de genes conocidos, su aplicaci´on queda limitada a la identificaci´on de nuevos miembros de familias de genes previamente caracterizadas. Por otro lado, dichas estrategias no permiten asegurar la detecci´on de genes completos y/o funcionales [Daniel, 2005, Simon y Daniel, 2009]. A´un as´ı se han identificado varios genes codificantes para enzimas novedosas, tales como deshidrogenasas, isomerasas y oxidasas [Neufeld et al., 2008, Parachin y Gorwa-Grauslund, 2011]. Estas metodolog´ıas tambi´en pueden ser utilizadas en la detecci´on de genes biomarcadores filo- gen´eticos. Por otra parte, la b´usqueda de clones basada en la detecci´on de una actividad enzim´atica de inter´es no depende del conocimiento previo de las secuencias de los genes que las codifican. En con- secuencia, los ensayos funcionales representan la ´unica estrategia con potencial para el descubrimiento de productos g´enicos novedosos [Ferrer et al., 2005, Heath et al., 2009, Steele et al., 2009]. Ejemplo de ello es la esterasa O.16 identificada y caracterizada por Ferrer y colaboradores, la cual posee una complejidad estructural y funcional mayor que el resto de las esterasas reportadas hasta ese momento [Ferrer et al., 2005]. Otra de las ventajas que posee esta estrategia funcional es que posibilita la iden- tificaci´on de genes completos y funcionales. Sin embargo, la detecci´on de los clones de inter´es puede verse condicionada, dado que la funcionalidad del gen clonado depende de la capacidad que posee el hospedador de expresar genes heter´ologos [Riesenfeld et al., 2004, Simon y Daniel, 2011]. Debido a que las estrategias moleculares y funcionales son complementarias, el uso de ambos tipos de an´alisis permite obtener mayor informaci´on sobre los genes en estudio.

La construcci´on y el an´alisis de bibliotecas metagen´omicas es considerada una tarea laboriosa, dado que a menudo es necesario analizar decenas de miles de clones para poder estudiar el potencial metab´olico de una comunidad. A pesar de ello, las bibliotecas metagen´omicas representan un reservorio importante de informaci´on gen´etica. A partir de ellas es posible llevar a cabo numerosos estudios, como por ejemplo analizar el contexto gen´omico de los genes identificados, evaluar la presencia de eventos de transferencia horizontal de genes y realizar ensayos posteriores de expresi´on hetr´ologa y caracterizaci´on bioqu´ımica [Ferrer et al., 2009].

1.3.3.2. Secuenciaci´on al azar del metagenoma

Esta estrategia metagen´omica consiste en la secuenciaci´on directa del ADN purificado a partir de una comunidad microbiana mediante plataformas de secuenciaci´on en gran escala [Shendure y Ji, 2008]. Dado que estas plataformas generan un gran n´umero de secuencias, la cobertura de an´alisis es significativamente mayor respecto de las metodolog´ıas descriptas anteriormente [Di Bella et al., 2013]. Esto posibilita realizar estudios sobre la diversidad y potencial metab´olico de una comunidad

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microbiana de una manera global y con una mayor resoluci´on [Krause et al., 2008]. Esta metodolog´ıa es aplicada frecuentemente para estudiar las diferencias existentes entre muestras ambientales a partir del an´alisis comparativo de sus metagenomas [Dinsdale et al., 2008]. Otra ventaja de esta estrategia es que no requiere del clonado previo de los fragmentos de ADN, reduciendo as´ı los tiempos de an´alisis. Sin embargo, las secuencias obtenidas por estas tecnolog´ıas de secuenciaci´on pueden presentar entre 25 y 1000 pares de bases de longitud, dificultando el estudio de genes completos, sus funciones y sus regiones lindantes. Programas especialmente dise˜nados para ensamblar este tipo de secuencias permiten generar fragmentos de ADN de mayor longitud (Tabla 1.2). No obstante, en aquellos casos donde las secuencias provienen de ADN de comunidades que poseen una alta diversidad, el ensamblado de las mismas generalmente se ve limitado [Di Bella et al., 2013]. Otro desaf´ıo que presenta esta estrategia, es que requiere de gran capacidad computacional para el an´alisis y procesamiento de la informaci´on generada.