6.2 Sample Preparation and Properties
6.2.3 Sample Surface Contamination
Curiosamente, las secuencias de inserción IS1071 son a menudo encontradas en plásmidos, principalmente los del grupo IncP-1, en los que frecuentemente flanquean a grupos de genes catabólicos formando transposones compuestos. La identificación de la secuencia de inserción IS1071, se realizó mediante PCR a partir de un set de primers (Materiales y Métodos, Tabla II.4) que amplifican el gen de la transposasa, tnpA, asociada a este elemento. Como resultado, se encontraron 24 aislamientos positivos para este marcador, lo cual indica una gran abundancia de esta transposasa en la colección bacteriana estudiada. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla IV.3. A fin de corroborar que se tratara de esta secuencia en
Tabla IV.3. Resumen de los resultados obtenidos por PCR para los determinantes de integrones de clase 1 y la secuencia de inserción IS1071
Aislamiento Integrones clase 1 IS1071
intI1 sul1 qacE qacEΔ1 orf513 tnpA
BF02 Ochrobactrum sp. + + + - - + BF13 Ochrobactrum sp. - - - - - + BF14 Cellulosimicrobium cellulans - - - - - + BF15 Ochrobactrum sp. - - - - - + BF19 Variovorax sp. + + + - - + BF21 Paenibacillus sp. - - + - - + BF22 Paenibacillus tundrae - - + - - + BF25 Pseudomonas putida + + + + - + BF27 Pseudomonas sp. + + + + - + BF28 Paenibacillus xylanexedens - - + - - - BF30 Bordetella sp. - ? - - - + BF31 Cellulosimicrobium sp. - + - - - - BF33 Pseudomonas putida - - - - - + BF36 Microbacterium sp. - - - - - + BF37 Serratia sp. - - - + BF42 Alcaligenes sp. + + + + - + BF43 Serratia sp. - - - - - + BF44 Microbacterium oxydans + + + + - + BF46 Serratia sp. - - - - - - BF48 Microbacterium sp. - + + + - + BF52 Brevibacterium sp. - - - - - + BF53 Agromyces cerinus - - - - - - BF55 Pseudomonas putida - + - - - - BF56 Acinetobacter sp. - - - - - - BF58 Pseudomonas sp. - - + - - - BF59 Sphingobacterium sp. - - - - - + BF60 Sphingobacterium sp. - - + - - - BF61 Pseudomonas sp. - - - - - + BF62 Pseudomonas sp. - - - - - - BF67 Pseudomonas sp. - - - - - - BF68 Pseudomonas sp. - - - - - + BF70 Bacillus pumilus - - - - - - BF71 Bacillus sp. - - - - - + BF73 Bacillus megaterium - - - - - + BF75 Pseudomonas sp. - - - - - +
particular, cinco productos de PCR elegidos al azar fueron secuenciados. Las secuencias obtenidas se analizaron en la base de datos ISFinder, la cual contiene una gran compilación de secuencias de inserción, y en la base de datos de GenBank. Ambos análisis indicaron que los fragmentos de PCR analizados correspondían a la secuencia del gen tnpA asociado a la IS1071.
Dado que se ha sido descripta a esta secuencia de inserción formando parte de esqueletos plasmídicos, particularmente aquéllos pertenecientes al grupo de incompatibilidad IncP (Tan, 1999, Ma, et al., 2007, Szczepanowski, et al., 2008), se procedió a analizar la presencia del gen tnpA en los transconjugantes obtenidos en las conjugaciones tri y biparentales detalladas previamente (Capítulo III, sección III.6). Nos propusimos evaluar si en los aislamientos portadores de plásmidos movilizables y conjugativos la IS1071 presenta localización plasmídica. Los resultados de la amplificación por PCR de secuencias específicas del gen tnpA en los transconjugantes obtenidos indicaron que en 4 de los 7 plásmidos movilizables (presentes en los aislamientos Microbacterium sp. BF36, Pseudomonas sp. BF61 y dos en Alcalígenes sp. BF42) la IS1071 se encontraba presente en dicho elemento.
IV.4. Discusión
En esta sección se ha analizado la presencia de dos MGEs potencialmente asociados a genes de resistencia a antibióticos y compuestos cuaternarios de amonio (integrones) y genes catabólicos (IS1071).
El trabajo realizado nos ha permitido identificar la presencia de integrones de clase 1 en 6 de los 35 aislamientos de la colección bacteriana. De los 6 aislamientos en los que se detectó la presencia de integrones, 5 corresponden a los géneros
Ochrobactrum, Variovorax, Pseudomonas y Alcaligenes (todos ellos Gram-negativos) y uno a Microbacterium (Gram-positivo). Los integrones de clase 1 son considerados de alta relevancia clínica, dado que en estos ambientes es en donde más se los ha encontrado y estudiado. Esta clase de integrones en particular resulta de gran interés debido a su amplia diseminación entre proteobacterias y su implicancia en la
propagación de genes de resistencia a antibióticos y desinfectantes, lo cual genera un grave problema a la hora de erradicar microorganismos potencialmente patógenos en ambientes hospitalarios. De hecho, se ha reportado en reiteradas ocasiones la presencia de integrones de clase 1 en altos porcentajes (hasta más del 50%) de bacterias aisladas de ambientes clínicos (Yousefi, et al., 2010, Nikokar, et al., 2013, Ahangarkani, et al., 2015). Sin embargo, estos elementos no son exclusivos de ambientes nosocomiales; por el contrario, se han encontrado en otros ambientes como suelos, aguas y sedimentos, aunque en estos casos la frecuencia de aparición es mucho menor que en hospitales. Trabajos previamente publicados indican frecuencias que oscilan entre valores menores al 1% y poco más del 10% cuando se trata de aislamientos no hospitalarios (Rosser & Young, 1999, Gaze, et al., 2005, Stokes, et al., 2006, Rosewarne, et al., 2010, Nardelli, et al., 2012). En nuestro caso, un 17% de los aislamientos de la colección transporta integrones de este tipo, lo cual indica una alta ocurrencia de estos elementos. También fueron identificados en una gran proporción de los aislamientos los genes qacE (34%), qacEΔ1 (14%) y sul1 (25%). El hecho de que haya un porcentaje mayor de aislamientos conteniendo estos genes indica que los mismos, en muchos casos, serían dispersados en el ambiente de manera independiente de los integrones de clase 1.
Teniendo en cuenta que se ha reportado la presencia de integrones de clase 1 en campos y granjas donde se crían animales y en otros ambientes contaminados con pesticidas y otros compuestos contaminantes (Binh, et al., 2009, Jechalke, et al., 2013, Dealtry, et al., 2014, Lopes, et al., 2014), se ha propuesto recientemente al gen de la integrasa intI1 como un posible marcador ambiental de contaminación antropogénica (Gillings, et al., 2015). Por lo tanto, el screening de este gen (y otros asociados a integrones) resulta una poderosa herramienta no sólo para la identificación de estas plataformas de ensamblado, sino para inferir en el grado de polución.
Finalmente, se detectó la secuencia de inserción IS1071 en un alto porcentaje de los aislamientos de la colección (68%), y se determinó su localización plasmídica en cuatro casos. La presencia de secuencias de inserción en plásmidos
movilizables/conjugativos en bacterias ambientales es una posible causa de su amplia distribución en bacterias (Soto, et al., 1992). Además de su participación en potenciales eventos de recombinación homóloga, su capacidad de transposición desde plásmidos a cromosomas y viceversa puede dar lugar a posibles intercambios de información genética entre los distintos replicones. Además, la presencia del elemento IS1071 es indicativa de la posible presencia de genes u operones catabólicos en estos elementos. Sin embargo, deberían realizarse ensayos adicionales si se quisiera establecer una asociación concreta entre las IS1071 detectadas y posibles genes catabólicos transportados en MGEs presentes en los aislamientos.