sefarosa. La proteína unida a Glutatión-S-transferasa se eluyó con glutatión, que compite con la glutatión-sefarosa y libera la proteína. Para ello se incubó el precipitado obtenido en el apartado anterior 5 min con 100 ml de tampón de elución suplementado con glutatión 10 mM. Tras la centrifugación se recuperó el sobrenadante y se repitió el proceso dos veces más. Como en el caso anterior, la fracción de proteína purificada se conservó a 4°C.
10.1.4. Fraccionamiento de proteínas en geles desnaturalizantes
(SDS-PAGE)
Las proteínas se fraccionaron en electroforesis en gel de poliacrilamida y SDS (SDS-PAGE; Laemmli, 1970). El gel se compuso de una zona de apilamiento de 2 cm de longitud seguida de una zona de fraccionamiento de 5 cm de longitud. Las electroforesis se realizaron en una cubeta Mini-Protean 3 Cell (Bio- Rad, Munich, Alemania) a la que se aplicó un campo eléctrico de 200 voltios durante 45 min. Como marcador de tamaño se utilizó una mezcla comercial de proteínas (Wide Molecular Weight Range, Sigma Chemical).
El gel de apilamiento al 4% se preparó con Tris-HCl 1,25 mM pH 6,8, 1 g/l de SDS y 40 g/l de acrilamida:N,N´metilenbisacrilamida 29:1 (p/p). La polimerización se generó por adición de 1 g/l de persulfato amónico y 1 ml/l de N,N,N`,N`-tetrametiletilenediamida (TEMED).
El gel de fraccionamiento al 12% se preparó con Tris-HCl 1,875 M pH 8,8, 1 g/l de SDS, 120 g/l de acrilamida:N,N`metilenbisacrilamida 29:1 (p/p), y se utilizó para polimerizar 1 g/l de persulfato amónico y 0,5 ml/l de TEMED.
Las muestras de proteínas se cargaron en el gel tras mezclarlas con tampón de carga 3x (65 mM TrisHCl pH 6.8, 20% (v/v) glicerina, 4% (p/v) SDS y 0,02% (p/v) azul de bromofenol y 10% (v/v)β-mercaptoetanol antes de cargar).
Una vez llevado a cabo el fraccionamiento, las proteínas se visualizaron sumergiendo el gel en solución de tinción (0,25 g/l de azul de Coomassie (Bri- lliant Blue R-250, Sigma Chemical), 100 ml/l de ácido acético y 100 ml/l de metanol) durante 30 min y en solución de destinción (100 ml/l de ácido acético y 100 ml/l de metanol) hasta que las bandas de proteínas fueron claramente visibles.
10.2. Ensayos in vitro
Los ensayos enzimáticos de proteína CarX o CarT se llevaron a cabo con suspensiones micelares del carotenoide en detergente. Estas se prepararon secando la cantidad deseada de carotenoide (50 µM deβ-caroteno o toruleno) por evaporación rotatoria bajo vacío a 30°C. La muestra seca se resuspendió en 200µl de benceno y se añadieron 150 µl de 0.7% (v/v) Triton X-100 y 1.6% (v/v) Triton X-405 disuelto en etanol 96%. La muestra se secó de nuevo por evaporación rotatoria en vacío hasta obtener un gel seco en el fondo del tubo. El gel se resuspendió cuidadosamente en 110µl de tampón de incubación 2x (HEPES-NaOH 200 mM pH 8.0, TCEP (Tris(2-carboxi-etil)fosfina HCl) 2 mM, FeSO40.4 mM y 2 g/l de catalasa). La muestra se centrifugó en una microcen-
trífuga a 10.000 rpm durante 5 min para eliminar los restos de carotenoide no disuelto. La incubación se llevó a cabo añadiendo 50 ml de proteína purificada a 50 ml de la muestra de carotenoide. A otros 50µl de la muestra de carotenoide se le añadieron 50 ml de proteína control.
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Los carotenoides sintéticos empleados, β-apo-8´-carotenal, β-apo-10´-carotenal yβ- apo-8´-licopenal, se procesaron de igual forma que elβ-caroteno y el toruleno, pero se disolvieron en una solución de detergente distinta, consistente en una solución etanólica de 4% (v/v) octilβ-D-glucopiranosido. El resto del tratamiento fue el descrito arriba.
Las incubaciones se llevaron a cabo durante 2 horas a 27°C, y se detuvieron añadiendo un volumen de acetona.
11. Análisis de carotenoides
11.1. Análisis de carotenoides de F. fujikuroi
11.1.1. Extracción y análisis del espectro crudo de las muestras
Se pesaron muestras de unos 0.1 g de micelio liofilizado y se trituraron con arena de mar en un mortero enfriado en hielo. Los carotenoides se extrajeron con acetona, se centrifugaron para eliminar los restos de micelio y arena y se secaron en un evaporador rotatorio conectado a una bomba de vacío (Büchi RE 111, Suiza) a una temperatura infe- rior a 50°C. Los extractos se disolvieron en n-hexano y se determinaron sus espectros de absorción de 350 nm a 650 nm utilizando un espectrofotometro Beckman, DU 640 (Beckman Coulter, Foullerton, California, EE.UU.).
11.1.2. Separación de carotenoides neutros y polares
Cada muestra de carotenoides se resuspendió en un volumen pequeño de éter de petróleo y se separó en óxido de aluminio (Al2O3, grado II-III) desactivado con 0,05 ml
de agua/g. El óxido de aluminio se secó previamente en un horno, se pesó, se cubrió con éter de petróleo, se le añadió el volumen adecuado de agua y se homogeneizó con una varilla de vidrio. Como soportes de la columna se usaron puntas azules de 1 ml taponadas en su extremo con papel de celulosa y cargadas con óxido de aluminio desactivado con agua hasta alcanzar 2 cm de altura. Cada muestra se cargó en una columna, se eluyeron los carotenos neutros con 1 ml de éter etílico, quedando retenidos en la columna los carotenoides polares. Las fracciones eluidas de la columna se secaron por evaporación rotatoria y se disolvieron en n-hexano para la determinación de su espectro de 350 nm a 650 nm en el espectrofotómetro.
El espectro de carotenoides polares se determinó mediante la diferencia entre el espectro de absorción de la muestra total y la muestra eluida de la columna corregidos a las mismas diluciones.
Para los cálculos de las concentraciones de carotenoides se utilizó un coeficiente de extinción de 171,5 (1 mg/l, 1 cm) para la neurosporaxantina. La concentración de la mezcla de carotenos neutros se estimó empleando un coeficiente de extinción medio de 250 (1 mg/l, 1 cm).
11.1.3. Cromatografía en capa fina (TLC)
Las cromatografías en capa fina se llevaron a cabo sobre hojas de TLC de plástico cubiertas por Silicagel 60 (Merck). La fase móvil utilizada en cada caso se especifica en el texto.