11.1.4. Cromatografía líquida de alta presión (HPLC)
Las muestras crudas de carotenoides se disolvieron en 500 µl de n-hexano y se inyectaron en un cromatografo líquido de alta presión (HPLC) Hewlett Packard Series 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, California, EE.UU.) equipado con un degasificador G1322A, una bomba cuaternaria G1311 y un detector de diodos en línea G1315A. Las muestras inyectadas (25 µl) se separaron en una columna de fase reversa de 4.6 x 100 mm Hypersil ODS (octadecylsilyl) 5 m (Waters Corporation, Milford, EE.UU.) utilizando una mezcla de metanol, acetonitrilo y cloroformo en una relación constante 47:47:6.
Los análisis llevados a cabo en la Universidad de Friburgo (Alemania) se realizaron con un equipo HPLC Waters system (Eschborn, Alemania) equipado con un detector de diodos en línea modelo 996. Las muestras se separaron en una columna C30 de fase reversa (YMC Europe, Schermbeck, Alemania) siguiendo protocolos descritos por Scherzinger et al. (2006). El toruleno se purificó a partir de una muestra de carotenoides del mutante SG68 usando el sistema de solventes A: metanol/tert-butil metil éter (1:1, v/v) B: metanol/tert- butil metil éter/agua (30:1:10, v/v/v). La separación se llevó a cabo con una tasa de flujo de 1 ml/min con un gradiente lineal a partir de un 100% hasta un 43% de B durante los primeros 43 min. En el minuto siguiente B pasó al 0%, y se mantuvo esta proporción durante 26 min a una tasa de flujo de 2 ml/min.
11.2. Análisis de carotenoides de E. coli
11.2.1. Protocolo básico de extracción
Se centrifugó el cultivo de E. coli, se eliminó el sobrenadante y se añadieron al precipitado 10 ml de acetona:metanol (7:3). Se agitó vigorosamente en Vortex y se sonicó durante 1 minuto en un sonicador digital Branson SLPe (Dietzenbach, Alemania) bajo los parámetros 15% duty cycle y 2,5 output control. A continuación se centrifugó a 14.000 rpm durante 5 min, se pasó el sobrenadante a un tubo nuevo y se añadieron 10 ml de éter de petroleo:dietil eter (1:4). Tras agitación en Vortex, se añadieron 5 ml de H2O, se centrifugó
durante 1 min a 14.000 rpm para separar las dos fases, se recogió la fase supe- rior y se secó en un rotoevaporador bajo vacío a temperatura ambiente. Finalmente, la muestra seca de carotenoides se resuspendió en un volumen apropiado (normalmente 100µl) para su análisis en HPLC.
11.2.2. Extracciones modificadas de carotenoides
En los casos de solapamiento de picos de retinoides en los cromatogramas de HPLC, se llevaron a cabo modificaciones químicas selectivas.
11.2.2.1. Acetilación de retinol
El precipitado seco de retinol (o la correspondiente fracción de HPLC) se disolvió en una mezcla de 100 µl de ácido acético y 200 µl de piridina y se incubó durante una hora en oscuridad. La reacción se detuvo añadiendo 300 ml de etanol. Después de la incubación en oscuridad, los compuestos lipofílicos (en este caso retinil ester) se extrajeron por partición con éter de petróleo y se
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secaron mediante rotoevaporación en vacío.
11.2.2.2. Extracción con formaldehido
El precipitado de E. coli de un cultivo de 50 ml se resuspendió en 150 µl de agua destilada y 50 µl de formaldehido (37%). La resuspensión se pasó a otro tubo eppendorf. Se añadió un volumen de metanol y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente (ó 30°C) en oscuridad. La reacción se paró añadiendo 600 µl de acetona. Los retinoides y carotenoides se extrajeron añadiendo 500 µl de eter de petroleo. La extracción con eter de petróleo se repitió dos veces y la muestra completa se secó por por rotoevaporación de vacío.
11.2.2.3. Extracción con hidroxilamina
El precipitado del cultivo de E. coli (apartado 11.2.1) se resuspendió en 200 µl de hidroxilamina 2M pH 6.8 y se pasó a un tubo Eppendorf. Se añadió un volumen de metanol y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. La reacción se detuvo añadiendo 600 µl de acetona. Los carotenoides y/o retinoides se extrajeron por adición de 500 µl de éter de petróleo. La extracción se repitió dos veces y la muestra completa se secó por rotoevaporación en vacío.
11.2.3. Análisis de Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas
(CG-EM)
Se utilizó un espectrómetro de masas Finnigan Trace DSQ acoplado a un cromatógrafo de gases Trace GC. Las separaciones se llevaron a cabo con una columna Zebron ZB5 (5% fenil - 95% dimetilpolisilanoxano, 0.25 mm I.D. y 0.25 µm de grosor; Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania). Para la cuantificación de retinal, se utilizó un programa con una temperatura inicial de 100°C durante 5 min, seguido de un incremento de 25°C/min hasta alcanzar los 320°C, que fueron mantenidos durante otros 5 min. Se mantuvo un flujo constante de helio a 1 ml/min usando una división de flujo de 1:30. El tiempo sin división de flujo fue de 3 min, y la temperatura del inyector fue de 220°C. Se utilizó una potencia iónica de 70 eV a 200°C. El retinal se identificó por comparación con el comportamiento cromatográfico de referencia y por comparación del espectro de masas con el proporcionado por el programa NIST Mass Spectral Search Program Version 2.0 (National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, Maryland y Boulder, Colorado, EE.UU).
12. Informática
12.1. Escritura, cálculo y dibujo
Para el tratamiento de los datos se usaron el procesador de textos Word y la hoja de cálculo y representación de datos Excel X de Microsoft (Microsoft Corp., Redmond, Washington, EE.UU.). Las imágenes digitalizadas se manejaron con el programa Photoshop 7.0 (Adobe Systems Inc., Mountain View, California, EE.UU.). En algunos casos se mejoró la calidad de las imágenes modificando parámetros que no alteran su información, como la latitud, o el brillo y contraste. Las gráficas, dibujos e imágenes se realizaron con el programa Canvas (Deneba Software, Miami, Florida, EE.UU.). Los espectros de carotenos se manejaron con la hoja de cálculo Excel X a partir de archivos
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