Para el desarrollo de la metodología, los ensayos se basaron en el manual de biomonitoreo de Débora-Jã de Araujo Lobos [139], el cual se fundamenta a su vez en estudios de biomonitoreo realizados en Brasil [145] [136] [140].
3.5.1. Descripción y preparación de plantas
Para poder mantener temperaturas y porcentajes de humedad estables para los biomonitores en crecimiento, las plantas de estudio se mantuvieron en un domo invernadero desarrollado e instalado en el CETAM-UTFSM (Figura 32). Para los ensayos de pelos estaminales se utilizó el híbrido de Tradescantia. ohiensis
y una especiedesconocida (T. ohiensis xunknown), llamado Tradescantia KU-20, el cual es un clon triploide (3x=18) heterocigoto para la pigmentación de sus flores (azul/rosa: siendo azul el color dominante). Por otro lado, para los ensayos de micronúcleos se utilizó Tradescantia pallida var. purpurea (Figura 32). Cabe destacar que el clon KU-20, es una especie muy sensible a la temperatura (entre 17.9ºC y 28ºC). Por lo tanto, es necesario un registro diario de las temperaturas y el porcentaje de humedad tanto externo como interno, para asegurar condiciones estables. El riego se realizó cada 3 días.
Figura 32:Domo-Invernadero del CETAM. Vista externa e interna
Previamente a cada ensayo de biomonitoreo se deben recolectar un mínimo de 15-20 inflorescencias de Tradescantia pallida var. purpúrea/ KU-20 por tratamiento y ambientarlas durante 24 horas en solución de Hoagland o en su defecto agua potable.
3.5.2. Exposición de los biomonitores en el BioToxMonitor
El equipo BioToxMonitor es un dispositivo de exposición de biomonitores con una configuración basada en módulos (Solicitud Patente PCT/CL2011/000021). Las cámaras de muestreo funcionan de manera independiente y están separadas las unas de las otras, evitándose así cualquier tipo de contaminación intracámara. En la Figura 33 se muestra el módulo completo del BioToxMonitor, en su configuración original para realizar ensayos de dosis-respuesta. Dada su concepción modular, el BioToxMonitor permite la separación de los módulos de bombas y de generación de aire limpio, para evitar que las vibraciones de las bombas y el generador interfieran en el buen funcionamiento de los módulos de 2 y 3 cámaras.
Figura 33: Vista isométrica de equipo BioToxMonitor completo, en su configuración de traslado, con los módulos de tres y dos cámaras, más el módulo generador de aire cero y el módulo de bombas.
La configuración equipo BioToxMonitor original (figura 33) fue modificado a un sistema de dos cámaras (figura 35) para simplificar la exposición de las plantas a las concentraciones bajas de material particulado evaluadas durante los ensayos vehiculares. Esta reducción del sistema BioToxMonitor fue validada previamente, para asegurar la concentración efectiva de cada uno de los contaminantes dentro del túnel de dilución y la cámara de exposición, mediante la determinación en paralelo de gases, partículas, carbonilos y HAPs con los equipos de medición portátil y cartridges de muestreo. Una vez realizada la validación del sistema de dos cámaras, se realiza la exposición de los biomonitores con emisiones contaminantes producidas durante los ensayos vehiculares. Esta exposición se realiza mediante la succión de las emisiones del túnel de dilución durante los tres ciclos NEDC de un combustible (diésel o biodiésel) dando una hora total de exposición por acumulación (tres ciclos de 20 minutos cada uno). La segunda cámara se dispone para el control positivo, exponiendo el biomonitor a formaldehído volátil desde un vial con peso conocido (figura 35). El control negativo se realizó evaluando un biomonitor expuesto a un ambiente de laboratorio limpio. Los biomonitores solo fueron expuestos a las emisiones de B0 (diésel) y B80 (80% biodiésel) con el propósito de obtener el mayor nivel de contraste de toxicidad entre las emisiones de los diferentes combustibles. Luego de la inducción viene una etapa de recuperación, donde se dejan 24 horas en agua potable.
Módulo Generador de Aire cero y compresor Módulo de bombas Módulo de 2 cámaras Módulo de 3 cámaras Cámara de muestreo
Figura 34: Representación esquemática del sistema experimental: el escape diésel entra en el túnel de dilución donde parte de la muestra se redirige al biomonitor dentro de la cámara de exposición. Los dispositivos de muestreo se conectan en paralelo de la siguiente manera: (A) Espectrofotómetro láser (B) Analizador de gases (C) Cartuchos DNPH (Carbonilos).
Figura 35: (A) Sistema de cámaras de exposición para biomonitores. (B) Biomonitores en periodo de
recuperación post-exposición.
3.5.3. Ensayo de micronúcleos (Trad-MCN)
Para el conteo de los micronúcleos se toman sólo los botones de las inflorescencias de Tradescantia pallida var. purpúrea. ya recuperados y se depositan en solución fijadora (1 parte de ácido acético por 3 partes de alcohol etílico 98º), durante un mínimo de 48 horas.
Desde la solución fijadora anterior, cada inflorescencia se separó en cada uno de los botones individuales que lo componen y se ordenaron de mayor a menor tamaño, comenzando el análisis desde el de tamaño medio para buscar aquel que contenga tétradas en su interior (Figura 36). El botón floral seleccionado se maceró sobre un portaobjeto con un bisturí histológico y se le agregó una gota de solución carmín, eliminando fibras y restos del botón. Se cubre con un cubreobjetos y se observa rápidamente en microscopio para ver si las
A
B
células se encuentran en estado de tétrada. Si se confirma lo anterior, el portaobjeto se calienta levemente con una llama para fijar el colorante y se apretándolo suavemente para fijar todo en un mismo plano. Si no se confirma la presencia de tétradas, la muestra se desecha y se repite esta preparación, con otro botón floral.
Se debe buscar la presencia de micronúcleos en las células madres de polen (Figura 36), producto del estrés al que fueron sometidas las inflorescencias. Los micronúcleos se observaron con un aumento de 100x en un microscopio óptico Olympus® CX-31. Cuando se encuentra un botón floral adecuado se observan las células madre en forma de tétradas donde el polen está encapsulado, mientras que los micronúcleos se observan como fragmentos nucleares en medio de la célula.
Figura 36: Esquema de la meiosis en Tradescantia. A partir de las 36 horas, los botones florales se encuentran en estado de tétradas, las cuales son adecuadas para la observación de micronúcleos al microscopio.
Las lecturas de micronúcleos se efectúan en un total 300 tétradas, dentro del botón floral seleccionado de cada una de las inflorescencias recolectadas. Se utilizó un contador de células para facilitar esta labor. Luego se estimó e informó, el número de micronúcleos por cada 100 tétradas. La metodología se resume en la Figura 38.
Figura 37: Diagrama metodológico del ensayo de micronúcleos.
3.5.4. Conteo de pelos estaminales (Trad-SH)
Para el conteo de pelos estaminales en la especie KU-20 también se realiza una recuperación de las inflorescencias con agua potable por 24 h posterior a la exposición. La visualización de los cambios de color se hace utilizando un microscopio estereoscópico SZ-CTV Olympus® con un iluminador de fibra óptica externo. A medida que van abriendo las flores, se les extraen con pinzas, cada uno de los 6 estambres los que se depositan en un portaobjetos con agua para facilitar su manipulación. Se cuenta el total de los pelos estaminales de los 2 primeros estambres analizados de cada flor, ya que estos se extrapolan a los restantes, y se contabilizan las células con cambios de color (morado a rosa) de los pelos estaminales analizados. El número de mutaciones se expresa en 1000 pelos estaminales mediante una regla de tres. Todo este procedimiento se realiza durante un período mínimo de una semana, en la cual se analizan diariamente las flores abiertas. Con el análisis de un total de 10 flores diarias por inducción se considera suficiente para obtener una representatividad estadística del ensayo [139].