proteínas claves en la adquisición del aprendizaje contextual como PSD-95, cdk5 y su activador específico p35, y de la interacción entre las mismas, en el hipocampo dorsal de sujetos de PN23 y PN17, en respuesta a la exposición a un contexto novedoso.
Esta serie experimental se realizó con el objetivo de correlacionar el aprendizaje contextual de ratas pre y post-destetadas con marcadores bioquímicos de la función de los NMDAr. El paradigma FCPC tiene la ventaja de separar el rol del HPC de otras estructuras involucradas en el aprendizaje contextual. Como ya se mencionó, este paradigma consta de 3 fases: pre-exposición, condicionamiento con descarga inmediata y evaluación. La explicación más aceptada del efecto del FCPC es que la representación configuracional del contexto se construye durante la fase de pre- exposición y depende de la función de los NMDAr. Por lo tanto, y luego de los resultados obtenidos en la serie experimental anterior, en esta serie nos preguntamos si es posible encontrar evidencias de actividad bioquímica, que involucre a estos receptores y a otras proteínas que interactúan con los mismos, en sujetos de las edades estudiadas en esta tesis, por la simple y mera exposición al contexto, simulando la fase de pre-exposición al contexto del FCPC.
En el experimento 3 evaluamos, en sinaptosomas de HPCd de sujetos de PN23 (Experimento 3a) y en crías pre-destetadas de PN17 (Experimento 3b) como primer abordaje, la expresión de la subunidad NR2B y la dinámica temporal de la misma, y del estado fosforilado de esta subunidad en el sitio específico Y1472, que está directamente involucrada, como se desarrolló en la introducción, con la inducción de plasticidad sináptica estructural dependiente de NMDA, en respuesta a la experiencia. Además, algunas de las proteínas reguladoras de la actividad de la subunidad NR2B, tales como PSD-95 y el complejo Cdk5/p35, se estudiarán en esta sección. La intención es graficar una curva de expresión temporal desde la finalización de la pre-exposición hasta los 70min aproximadamente. Luego del análisis de la expresión de estas proteínas se analiza en esta serie la interacción entre algunas de ellas (PSD-95 y Cdk5,
133
específicamente) a través de un ensayo de inmunoprecipitación (Experimento 3c), para así profundizar y probar la hipótesis de interacción entre los actores propuestos en la tesis (Cdk5 y NR2B, indirectamente a través de PSD-95), lo que se realizó en una sola de las edades (PN23) en un tiempo específico posterior a la preexposición (a los 40 minutos, debido a los resultados obtenidos en los experimentos 3a y 3b).
Experimento 3a – PN23
La Figura 22 (compuesta por las figuras 22a y 22b) refleja los resultados
encontrados en la expresión de las proteínas evaluadas (en la Fig.22a: NR2B y NR2BY; y en la 22b: PSD-95, Cdk5 y p35) en sinaptosomas de HPCd de sujetos de PN23.
El ANOVA realizado para evaluar la expresión de NR2B (subunidad total) en fracciones sinaptosomales de HPCd de sujetos de PN23, no mostró diferencias significativas entre animales pre-expuestos al contexto de condicionamiento y no pre- expuestos, en ningún punto de la curva temporal. De manera interesante, encontramos al estudiar a la subunidad activada por la fosforilación en el sitio Y1472 (NR2BY1472), una curva de expresión que se hace significativa en ciertos minutos de la misma con respecto a los controles no pre-expuestos [F(8, 25)=5,6789, p<0.05], estos son a los 40 y 50 minutos posteriores a la exposición al contexto novedoso, tal como se observa en la Figura 22a.
134
Por otra parte, los niveles de expresión de Cdk5, p35 y PSD95 no mostraron un patrón temporal diferencial en ninguno de los puntos, sugiriendo que la expresión total en sinaptosomas de HPCd de estas proteínas, es similar en sujetos No pre- expuestos y pre-expuestos, y que esta similitud se mantiene en el tiempo (hasta los 70min). Los datos se resumen en la Figura 22b.
Fig.22a: NR2BY1472 aumenta sus niveles de expresión luego de la pre-exposición a un contexto novedoso en sujetos de PN23. Curva temporal de los niveles de expresión de NR2B y NR2BY1472 en fracciones sinaptosomales de HPCd de sujetos de PN23, No Pre- expuestos al contexto (NP) y pre- expuestos (P), obtenidos a diferentes tiempos posteriores a la pre-exposición. La figura muestra el análisis de Western Blot que se encuentra cuantificado en las subfiguras siguientes para NR2B/Tub y para NR2BY/NR2B. Se observa un marcado incremento de los niveles de NR2BY1472/NR2B a los 40 y 50 min. posteriores a la pre-exposición. Las barras verticales ilustran el error estándar de la media. *p<0,05
180 KD 50 KD 180 KD
135 Fig.22b: La expresión de proteínas relacionadas a plasticidad sináptica, PSD- 95, Cdk5 y p35, no se ve modificada por la pre-exposición a un contexto novedoso en sujetos de PN23. Curva temporal de los niveles de expresión de PSD-95, Cdk5 y p35 en fracciones sinaptosomales de HPCd de sujetos de PN23, No Pre-expuestos al contexto (NP) y pre-expuestos (P), obtenidos a diferentes tiempos posteriores a la pre-exposición. No se observan diferencias en la expresión temporal de ninguna de estas proteínas, ni se observan modificaciones en la expresión de las mismas en respuesta al tratamiento de pre- exposición. Las barras verticales ilustran el error estándar de la media. *p<0.05
Experimento 3b – PN17
La Figura 23 (compuesta por 23a y 23b) refleja los resultados encontrados en la expresión de las proteínas evaluadas en sinaptosomas de HPCd de sujetos de PN17.
El ANOVA para evaluar la expresión temporal de las proteínas de interés de sujetos de PN17 no reflejó efectos principales en la expresión de NR2B/TUB. Al igual que lo observado en los sujetos PN23, la expresión de la subunidad fosforilada con respecto al total, demostró una curva temporal de activación que fue significativa con respecto a los controles en los minutos 20 y 40 posteriores a la pre-exposición [F(4, 22)=2,8362, p<0.05], estos resultados se resumen en la Figura 23a.
Nuevamente, a esta edad, no se observaron diferencias en la expresión temporal en sinaptosomas de HPCd de cdk5, p35 ni PSD-95. Los resultados se observan en la Figura 23b.
136
50 KD
Fig.23a: Aumento de la expresión de NR2BY1472 luego de la pre-exposición en un contexto novedoso en sujetos de PN17. Curva temporal de los niveles de expresión de NR2B y NR2BY1472 en fracciones sinaptosomales de HPCd de sujetos de PN17, No Pre-expuestos al contexto (NP) y pre-expuestos (P), obtenidos a diferentes tiempos posteriores a la pre-exposición. La figura muestra el análisis de Western Blot que se encuentra cuantificado en las subfiguras siguientes para NR2B/Tub y para NR2BY/NR2B. Se observa un marcado incremento de los niveles de NR2BY1472/NR2B a los 20 y 40min. posteriores a la pre-exposición. Las barras verticales ilustran el error estándar de la media. *p<0,05
180 KD 180 KD 50 KD
137 Fig.23b: La expresión de proteínas relacionadas a plasticidad sináptica, PSD-95, Cdk5 y p35, no se ve modificada por la pre- exposición a un contexto novedoso en sujetos de PN17. Curva temporal de los niveles de expresión de PSD-95, Cdk5 y p35 en fracciones sinaptosomales de HPCd de sujetos de PN17, No Pre-expuestos al contexto (NP) y pre-expuestos (P), obtenidos a diferentes tiempos posteriores a la pre- exposición. No se observan diferencias en la expresión temporal de ninguna de estas proteínas, ni se observan modificaciones en la expresión de las mismas en respuesta al tratamiento de pre-exposición. Las barras verticales ilustran el error estándar de la media. *p<0.05
En resumen, la serie experimental número 3, en sus subsecciones a y b revelaron, tanto en PN23 (3a) como PN17 (3b), una actividad dinámica del estado fosforilado de NR2B (NR2BY1472), el cual se ha relacionado funcionalmente con la localización subcelular de los NMDAr, y de esta manera, con su disponibilidad para la sinapsis. Los datos obtenidos en esta serie mostraron un aumento en la expresión del estado fosforilado de la subunidad NR2B (y no de la expresión total de la subunidad), posterior al tratamiento de pre-exposición en un contexto novedoso, observado en comparación a los niveles de expresión en los controles no pre-expuestos. De manera interesante, esta curva de expresión temporal se detectó en ambas edades, a los PN23 y a los PN17, mostrando un patrón de curva en respuesta a la adquisición de información contextual (Figs.22 y 23).
138
Experimento 3c – PN23: Inmunoprecipitación de PSD-95
Teniendo en cuenta los resultados previos en los cuales mostramos un aumento significativo en la expresión del estado fosforilado de la subunidad NR2B a los 40 y 50 minutos posterior al tratamiento de pre-exposición en un contexto novedoso en comparación a los niveles de expresión en los controles no pre-expuestos, abordamos el estudio de la interacción entre PSD-95 y la proteína Cdk5. El objetivo de este análisis fue evaluar si hay una alteración en la interacción entre estas proteínas durante la adquisición de aprendizaje contextual, y de este modo contribuír con más evidencias a la hipótesis sostenida por diversos autores que indica que la proteína Cdk5 regula de manera negativa a esta función (Hawasli et al., 2007; Bianchetta et al., 2012), mediante la interacción con PSD-95 en el dominio de esta proteína de anclaje, que es a su vez el sitio de unión a NR2BY1472 con el cual compite, y que esta subunidad requiere para su inserción en la membrana sináptica durante el aprendizaje (Morabito et al., 2004; Zhang et al., 2008a).
Para ello, se evaluaron los niveles de expresión de Cdk5 que co- inmunoprecipitaron con PSD-95 en sinaptosomas de HPCd de sujetos de PN23 luego de 40 minutos de preexposición a un contexto novedoso, uno de los tiempos en el que se encontró un aumento significativo en la expresión de NR2B fosforilado en el sitio Y1472 (experimento 3a). Consideramos este experimento como un piloto debido a que se utilizaron sólo 3 sujetos para cada condición, realizando un pool, debido a la imposibilidad de realizarlo de manera individual por la poca cantidad de muestra que se obtiene a partir del fraccionamiento de sinaptosomas, y, además, sólo se utilizó el tercio superior del HPC que corresponde a un segmento enriquecido en HPCd.
En primer lugar, se ensayó la eficiencia del anticuerpo para inmunoprecipitar PSD-95. En la figura 24 se observa la presencia de PSD-95 tanto en el sobrenadante del inmunoprecipitado (SN) y en el inmunoprecipitado propiamente dicho (IP), confirmando la eficiencia del anticuerpo.
139
Posteriormente, se analizó la presencia de la proteína Cdk5 en el IP, lo cual indica que co-inmunoprecipita con PSD-95 en ambas condiciones experimentales. A partir de este hecho, se cuantificaron los niveles de expresión de Cdk5 en relación a los de PSD-95 inmunoprecipitada, a través de la relación Cdk5/PSD-95 en ambos grupos experimentales. Este análisis nos mostró que los sujetos que no fueron preexpuestos al contexto novedoso (NP) presentaron mayores niveles de Cdk5 asociada a PSD-95 que aquellos que fueron pre-expuestos al contexto (P). Esta primera aproximación nos estaría indicando que podría existir una relación inversa, entre Cdk5 y NR2B, a través de PSD-95, en el proceso de adquisición de aprendizaje contextual, con respecto a su participación y contribución, mediante su localización subcelular, lo cual fue propuesto como hipótesis de esta tesis.
Fig.24: Asociación entre CDk5 y la proteína de anclaje PSD-95 en respuesta a la pre-exposición a un contexto novedoso. Ensayo de inmunoprecipitación (IP) de PSD-95 de sinaptosomas de HPCd realizado en sujetos de PN23, No Pre-expuestos al contexto (NP) y Pre-expuestos (P), a los 40min posteriores a la pre-exposición. Se observan las bandas de las fracciones correspondientes al sobrenadante (SN) del IP y al IP propiamente dicho. La evaluación de la expresión de Cdk5 en relación a PSD-95 en el IP fue mayor en sujetos NP que en P, lo cual se encuentra cuantificado en la figura. No se observan barras correspondientes al error estándar de la media debido a que se realizó este ensayo con un pool de sinaptosomas de 3 sujetos de cada condición.
95 KD 35 KD
140
Sin embargo, y debido a que este abordaje es preliminar, es necesaria la realización de experimentos que apunten a dilucidar esta interacción, así como también completar el número de réplicas de esta serie para fortalecer los resultados. Los hallazgos preliminares se encuentran representados en la Figura 24.
5.4 Serie experimental 4: Evaluación del número y tipo de espinas dendríticas en el